武汉大学微生物学陈向东上课笔记

微生物学

陈向东

第I章绪论

三、微生物与我们

微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中。

▲细菌数亿值土壤，土壤中的细菌总重量估计为：10034X1012吨;

▲每张纸币带细菌：900万个；

▲人体体表及体内存在大量的微生物：

皮肤外表：平均10万个细菌/平方厘米；

口腔；细菌种类超过500种；

肠道：微生物总量达100万亿，

粪便干重的1/3是细菌，每克粪便的细菌总数为：1000亿个；

▲每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为8500万；

时时刻刻与微生物“共舞”

是祸？是福？

微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友！

微生物是人类的朋友！

▲微生物是自然界物质循环的关键环节；

上体内的正常菌群是人及动物健康的根本保证；

帮助消化、提供必需的营养物质、组成生理屏障

▲微生物可以为我们提供很多有用的物质；

有机酸、酶、各种药物、疫苗、面包、奶酪、啤酒、酱油等等

▲基因工程为代表的现代生物技术；

少数微生物也是人类的敌人！

鼠疫：

天花；

艾滋病；

疯牛病：

埃博拉病毒；

可以说，微生物与人类关系的重要性，你

怎么强调都不过分，微生物是一把十分锋利的

双刃剑，它们在给人类带来巨大利益的同时也

带来“残忍”的破坏。它给人类带来的利益不仅

是享受，而且实际上涉及到人类的生存。

“在近代科学中，对人类福利最大的一门科学，

要算是微生物学了。”

——日本学者尾形学在“家畜微生物学”(1977)

四、微生物的发现和微生物学的建立与开展

(­)微生物的发现

▲我国8000年前就开始出现了曲集酿酒；

▲4000年前埃及人已学会烘制面包和酿制果酒；

▲250()年前创造酿酱、醋，用曲治消化道疾病；

▲公元六世纪(北魏时期)贾思勰的巨著“齐民要术

▲公元2世纪，张仲景：禁食病死兽类的肉和不清洁食物：

▲公元前112年-212年间,华佗：“割腐肉以防传染”；

▲公元九世纪痘浆法、痘衣法预防天花；

▲1346年，克里米亚半岛上的法卡城之战（粗坦人-罗马人）：

▲16世纪，古罗巴医生GFracastoro：疾病是由肉眼看不见的生物（livingcreatures）引起口勺；

▲1641年，明末医生吴又可也提出“戾气”学说；

▲1664年，英国人虎克（RobertHooke）曾用原始的显微镜对

生长在皮革外表及蔷薇枯叶上的霉菌进行观察。

▲1676年，微生物学的先驱荷兰人列文虎克（Antonyvanleeuwenhoek）首次观察到「细菌。他没

有上过大学是一个只会荷兰语的小商人，但却在1680年被选为英国皇家学会的会员。列文虎克

利用业余时间制造过400多架单式显微镜和放大镜，放大率一般为50-200倍，

[二）微生物学的奠基

1.巴斯德

（1）发现并证实发酵是由微生物引起的：

化学家出生的巴斯德涉足微生物学是为了治疗“酒病”和“蚕病”

⑵彻底否认了“自然发生”学说；

著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实，空气内确实含有微生物，

是它们引起有机质的腐败。

（3）免疫学——预防接种

首次制成狂犬疫苗

（4）其他奉献

巴斯德消甫法：60〜65℃作短时间加热处理，杀死有宙微生物

2柯赫

il）微生物学根本操作技术方面的奉献

ai细菌纯培养方法的建立

土豆切面一营养明胶一营养琼脂（平皿）

b）设计了各种培养基，实现了在实验室内对各种微生物的培养

ci流动蒸汽灭菌

d）染色观察和显微摄影

[2）对病原细菌的研究作出了突出的奉献：

al具体证实/炭疽杆菌是炭疽病的病原菌；

b）发现了肺结核病的病原菌；（1905年获诺贝尔奖）

4证明某种微生物是否为某种疾病病原体的根本原则

——著名的柯赫原则

1、在每一相同病例中都出现这种微生物；

2、要从寄主别离出这样的微生物并在培养基中培养出来；

3、用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会

重复发生；

4、从试验发病的寄主中能再度别离培养出这种微生物来。

（三）微生物学开展过程中的重大事件

（见讲义P4表1-1微生物学开展中的重大事件）

▲1890VonBehring制备抗毒素治疗白喉和破伤风；

▲1892Ivanovsky提供烟草花叶病毒是由病毒引起的证据；

▲1928Griffith发现细菌转化；

对其机理的研究导致DNA是遗传物质确实证；

外源遗传物质导入各种细胞的基因重组技术的建立；

▲1929Fleming发现青霉素；

▲1944Avery等证实转化过程中DNA是遗传信息的载体；

▲1953Watson和Crick提出DNA双螺旋结构：

▲1970〜1972Arber、Smilh和Nalhans发现并提纯了

DNA限制性内切酶

▲1977Woese提出古生菌是不同于细菌和真核生物的特殊类群

Sanger首次对fXP4噬菌体DNA进行了全序列分析：

▲1982〜1983Prusincr发现肮病毒（prion）；

▲1983〜1984Mullis建立PCR技术；

▲1995第一个独立生活的细菌（流感嗜血杆菌）全基团组序列

测定完成；

▲1996第一个自养生活的古生菌基因组测定完成；

▲1997第一个真核生物（岬洒酵母）基因组测序完成；

【四）20世纪的微生物学

十九世纪末到二十世纪中期：

微生物学：鉴定病原菌、

研究免疫学及其在预防疾病中的作用、

寻找化学治疗药物、

分析微生物的化学活性。

普通生物学：细胞的构造及其在繁殖和开展中的作用、

植物和动物的遗传和进化的机制。

动、植物的生命活动规律

适用于结构大大简单的微生物？

肌肉的糖酹解酵母菌乙醇发酵

本质上的同一性

相同融学本质

多种辅酶的前体

辅酶为细胞代谢所必需

【一切生命系统在代谢水平上具有相同的本质）

“生物化学的同一性”

牛化突变细

微生物遗传学

对动植物起作用的遗传机制同样适用于微生物

肺炎双球菌转化实验f

病毒重组实验核酸是遗传汨物质根底

噬菌体感染实验J

20世纪40年代后，微生物自身的特点使其成为生物学

研究的“明星”，微生物学很快与生物学主流集合，并被推到

了整个生命科学开展的前沿，获得了迅速的开展，在生命科

学的开展中作出了巨大的奉献。

微生物学与生物学开展的主流集合、交叉，

获得了全面、深入的开展

［见P3图1-1微生物学的主要分支学科）

（五）微生物学在生命科学开展中的重要地位

1.微生物是生物学根本理论研究中的理想实验对象，

对微生物的研究促进许多重大生物学理论问题的突破

▲基因和酶关系的说明及“一个基因一个酶”的假说；

1941年Beadle和Tatum用粗糙脉胞霉进行的突变实验使基因和酶的关系得以说明，并提出了“一个

基因一个酶”的假说。

▲遗传的物质根底的说明；

▲基因概念的开展；

“断裂基因”、“跳跃基因”、“重叠基因”的发现，以及基因结构的精细分析、基因组测序等。

▲遗传密码的破译；

60年代Nirenberg等人通过研究大肠杆菌无细胞蛋白质合成体系

及多聚尿昔酶，发现了苯丙氨酸的遗传密码，继而完成了全部

密码的破译，为人类从分子水平上研究生命现象开辟了新的途径。

▲基因表达调控机制的研究；

Jacob等通过研究大肠杆菌诱导酶的形成机制而提出操纵子学说，

说明了基因表达调控的机制，为分子生物学的形成奠定了基础。▲

生物大分子合成的中心法则；

DNAfRNAf蛋白质

2.对生命科学研究技术的奉献

细胞的人工培养；

突变体筛选；

DNA重组技术和遗传工程；

3.微生物与“人类基因组方案”

作为模式生物；

基因与基因组的功能研究的重要工具；

（五）我国微生物学的开展

汤飞凡：沙眼病原体的别离和确证

陈华癸：根瘤菌固氮作用的研究

高尚荫：创立了我国病毒学的根底理论研究

和第一个微生物学专业

抗生素的总产量己耀居世界首位

两步法生产维生素C的技术居世界先进水平

泉生热抱菌全基因组序列测定

［六）21世纪微生物学展望

1.微生物自身的特点〔共性和特性）将会更加受到关注和利月

共性：微生物具有其他生物共有的根本生物学特性：生长、

繁殖、代谢、共用一套遗传密码等，甚至其基因组

上含有与高等生物同源的基因，充分反映了生物高

度的统一性。

特性：微生物具有其它生物不具备的生物学特性，例如可在

其他生•物无法生存的极端环境下生存和繁殖，具有其

他生物不具备的代谢途径和功能，反映了微生物极其

丰富的多样性。

▲以微生物为研究材料继续对•些根本生命现象进行研究：

▲生物进化方面的研究；

在微生物基因组上进行的考古

▲性别分化的意义；

基因水平转移一细菌DNA的主动分泌与摄取

▲生物智慧的开展；

聪明的黏菌

▲生命起源的研究；

▲极端环境的微生物的研究：

▲微生物产业的开发；

▲重要致病菌的特点及其防治；

微生物自身特性的进一步开发、利用：例如降解性塑料，分解纤维素、生产单细胞蛋白等。

借助（利用）微生物特点的基因工程产业：利用微生物生产原本它们不能生产的药物、疫苗等。

减生物具备生命现象的特性和共性，将是21世纪进一步解决生物学重大理论问题，如生命起源与进化,

物质运动的根本规律等，和实际应用问题，如新的微生物资源的开发利用，能源、粮食等的最理想的材

料。

（见讲义P10）

2.与其他学科实现更广泛的交叉，获得新的开展学科交叉永远是科学创新的源泉！

▲微生物基因组的序列测定和分析；

▲微生物的快速检定；

▲微量热技术对生命过程的研究；

▲计算机技术与微生物学的结合；

微生物的特点：

个体小、结构简、胃口大、食谱广、

繁殖快、易培养、数量大、分布广、

种类多、级界宽、变异易、抗性强、

休眠长、起源早、发现晚

个体小：

测量单位：微米或钠米

结构简：

无细胞结构（病毒）；

单细胞；

简单多细胞；

胃口大：

消耗自身重量2000倍食物的时间：

大肠杆菌：1小时

A：500年（按400斤/年计算）

食谱广：

微生物获取营养的方式多种多样，其食谱之广是动植物完全无法相比的！

纤维素、木质素、几丁质、角蛋白、石油、甲醇、甲烷、天然气、塑料、酚类、甄化物、各种有机物均

可被微生物作为粮食

繁殖快：

大肠杆菌一个细胞重约10-12克，平均20分钟繁殖一代

24小时后：4722366500万亿个后代，重量到达：4722吨

48小时后：2.2X1043个后代，重量到达2.2X1025吨

相当于4000个地球的重量！

一头500kg的食用公牛，24小时生产0.5kg蛋白质，

而同样重量的酵母菌，以质量较次的糖液（如糖蜜）

和氨水为原料，24小时可以生产50000kg优质蛋白质。

易培养：

很多细菌都可以非常方便地进行人工培养！

数量大：

在自然界中（土壤、水体、空气，动植物体内和体表）都生存有大量的微生物！

分布广：

人迹可到之处，微生物的分布必然很多，

而人迹不到的地方，也有大量的微生物存在！

▲数十公里的高空［最高为离地85公里，须用火箭采样）；

▲几千米的地下：

▲强酸、强碱、高热的极端环境；

▲常年封冻的冰川；

种类多：

▲微生物的生理代谢类型多；

▲代谢产物种类多：

▲微生物的种数“多”；

虽然目前已定种的微生物只有大约10万种，远较动植物为少•但一般认为目前为人类所发现的微生物

还不到自然界中微生物总数的1%

级界宽：

Whittaker的五界分类系统

Woese三原界分类系统

变异易：

个体小、结构简、且多与外界环境直接接触

繁殖快、数量多

▼'突变率：10-5-10-10

短时间内产生大量的变异后代

青霉素的生产：20单位/ml（1943）10000单位/ml

青霉素的用量：最高：10万单位/天（40年代）数百万-千万单位/次

细菌抗药性的产生：

抗（逆）性强：

抗热：有的细菌能在265个大气压，250°C的条件下生长；

自然界中细菌生长的最高温度可以到达113°C；

有些细菌的芽狗，需加热煮沸8小时才被杀死；

抗寒：有些微生物可以在一12℃~—30℃的低温生长；

抗酸碱：细菌能耐受并生长的pH范围：pH0.5~13；

耐渗透压:蜜饯、腌制品，饱和盐水（NaCl,32%）中

都有微生物生长；

抗压力：有些细菌可在1400个大气压下生长；

休眠长：

世界上最古老的活细菌（芽抱）：2.5亿年

Nature407,897-900（2（X）0）

起源早：

38亿年前，生命在海洋中出现

26亿年前，陆地上就可能存在微生物

发现晚：

300多年前人们才真正发现微生物的存在

微生物的特点：

个体小、结构简、胃口大、食谱广、

繁殖快、易培养、数量大、分布广、

种类多、级界宽、变异易、抗性强、

休眠长、起源早、发现晚

第2章纯培养和显微技术

微生物的根本特点：小！

▲在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性；

▲微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；

"A培养技术在微生物学中具有重要意义！

在研究中所使用的微生物培养群体：

培养物：在•定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体

工混合培养物；含有多种微生物的培养物；

t纯培养物：只有一种微生物的培养物；

通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果

纯培养技术是进行微生物学研究的根底！

微生物的根本特点：小！

微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物

研究的另•项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态

及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。

第一节微生物的别离和纯培养

从混杂的群体中别离特定的某一种微生物，

是研究和利用微生物的第一步。

一、无菌技术

人用于别离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；

▲在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；

1、微生物培养的常用器具及其灭菌

常用的器具：试管、瓶子、培养皿等

1887年，RJPetri创造,Petridish

常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌

高温干热灭菌

2、接种操作

无菌操作：火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行

在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行

二、用固体培养基别离纯培养

液体培养基；

培养基d固体培养基：]

L半固体培养基；亚脂一

柯赫（RobertKoch）的助手WHeese和他的夫人FranHeese

菌落"colony）：

单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基外表或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉

眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体

众多菌落连成一片

菌苔（laun）

不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般

都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微

生物进行分类、鉴定的重要依据（见P14图2-3）。

同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落

二、用固体培养基别离纯培养

使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的根本方法：稀释！

1、稀释倒平板法

操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！

2、涂布平板法

使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！

3、平板划线法

4.厌氧微生物的别离

厌氧罐

厌氧手套箱

稀释摇管法

三、用液体培养基别离纯培养

稀释法进行液体别离必须在同一个稀释度的许多

平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。

例如：假设同一稀释度的试管中有95%表现为不生长，那么

生长的试管中仅含一个细胞的几率为：4.8%；

含二个细胞的几率为：0.12%；

含三个细胞的几率为：0.002%

__________0048____________=0.975

0.048+0.0012+0.0002

在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为97.5%

1878年，Lister别离乳酸链球菌时所使用的微量注射器和酒杯培养装置

注射器的最小吸取量：0.00062亳升

四、单细胞〔刑子）别离

▲一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；

▲操作难度与细胞或个体的大小成反比；

王、选择培养别离

微生物群落中数量占少数的微生物的别离纯化：

▲抑制大多数其它微生物的生长；

人使待别离的微生物生长更快；

巾一）使待别离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。

｛没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基

都是选择性的。）

▲使待别离的微生物生长“突出”；

上一〉直接挑取待别离的微生物的菌落获得纯培养。

1.利用选择平板进行直接别离

待别离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制

▲高温下培养：别离嗜热细菌；

人培养基中不含N：别离固氮菌；

▲培养基加抗生素：别离抗性菌；

待别离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物

▲牛奶平板：别离蛋白酶产生菌；

▲颜色反响：别离特定的菌株；

▲利用特定细菌的滑动特点进行

别离纯化；

第二节显微镜和显微技术

几个根本概念:

放大被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！

/辨率能区分两点之间最小距离的能力

•差被观察物区别于背景的程度

学显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微境的正确使用及良好的标本制作和观察技

术，这就是显微技术。

一、显微镜的种类及原理

1.普通光学显微镜

复式显微镜

简单显微镜

光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？

目镜：10~15X：物镜：100X；总放大倍数10007500义；

如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？

使用油镜，即在100义物镜和载玻片之间滴加香柏油；

分辨率与所用波长成反比！

0.51

分辨率［最小可分辨距离)=--------

nsinq

q为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离

N:玻片与物镜间介质的折射率

空气(『1.0)、水(n=1.33)、香柏油(n=1.52)、玻璃(n=1.54)

显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质

光线在穿过折射率不同的介质时发生折射

用浸没油取代空气的作用：

介质折射率提高数传孔径值和分辨率均得到提高

浸没油与玻璃的折射率相近^

很多原来由于在透镜及载片外表的反射和折射而损失的

光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。

光学显微镜物镜的特性

人眼的分辨能力在0.2mm左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数(使用油镜)是LOOOX到1,500

X。

2.暗视野显微镜

普通光学显微镜又称明视野显微镜其照明光线直接进入视野，属透射照明。

3.相差显微镜

形成亮背景暗物象的结果

4.荧光显微镜

5.透射电子显微镜；

6.扫描电子显微镜

能否用扫描电镜来观察样品的内部结构，而用透射电镜来观察样品的外表结构？

7.扫描隧道显微镜

二、显微观察样品的制备

略！

第二章思考题：

1、为什么说Koch等建立的微生物纯培养技术是微生

物学建立与开展的基石？一般可用哪些方法获得

微生物的纯培养？

2、微生物的最显著特征就是个体微小，通常只能通过

显微镜进行观察。试列举在显微观察中通过改变样

品的反差以改善观察效果的技术及方法。

第3章微生物类群与形态结构

古生菌在进化谱系上与真细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与其细菌较为

接近，同属于原核生物。

第一节真细菌(Eubacteria)

一、一般形态及细胞结构

(-)个体形态和排列

「球状

根本形态杆,

L螺旋状

1、球状

细胞个体呈球形或椭圆形，不同种的球菌在细胞分裂时会形成不同的空间排列方式，常被作为分类

依据。

金黄色葡萄球菌

淋病奈瑟氏球菌

肺炎链球菌

2、杆状

细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细(直径)比拟稳定，而长度那么常囚培养时间、培养条件不同而

有较大变化。

杆状细菌的排列方式常因生长阶段和培养条件而发生变化，一般不作为分类依据。

枯草芽泡杆菌

地衣芽泡杆菌

铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)

结核分枝杆菌

炭疽病的病原菌一炭疽杆菌

破伤风梭菌

弧菌：菌体只有一个弯曲，其程度缺乏一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。

霍乱弧菌

寄生性弧菌--蛭弧菌

螺旋菌：菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异c鞭毛一端生，细胞壁坚韧，菌体较硬C

螺旋体菌：菌体柔软，用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。

梅毒密螺旋体

4、其它形状

1）柄杆菌（prosthccatcbacteria）

细胞上有柄（stalk）、菌丝（hyphae）、附器Appendages）等细胞质伸出物,细胞呈杆状或梭状,并

有特征性的细柄。一般生活在淡水中固形物的外表，其异常形态使得菌体的外表积与体积之比增加，能

有效地吸收有限的营养物；

2）星形细菌（star-shapedbactena）

3）方形细菌（squarc-ah叩cdbacteria）环

境

4）异常形态条

环境条件的变化：件

恢

物理、化学因子的刺激一阻碍细胞正常发育复

培养时间过长一细胞衰老一正

常

营养缺乏异常形态

自身代谢产物积累过多-

（二）大小

1、范围

最小：与无细胞结构的病毒相彷（50nm：）

最大：肉眼可见（0.75mm）；

［参见P33,最小和最大的细菌）

费氏刺骨伯.菌（0.08mmx0.6mm）（切〃加力比大肠杆菌大100万倍（1985年发现）

德国科学家H.N.Schulz等1999年在纳米比亚海岸的海底沉积物中发现的一种硫磺细菌（sulfur

bacterium）,其大小可达0.75mm,Thiomargaritananubiensis>--------“纳米比亚硫磺珍珠”

最大和最小细菌的个体大小悬殊：

(Thiomargantanamibiensis)(0.75mm)

10亿~100亿倍

（nanobacteriaJ（5（）nin）

光学显微镜物镜的特性

在对细菌进行光学显微镜观察时，油镜最常使用，也最为重要。

一般细菌的大小范围：

0.5-1mm（直径）

0.2~1mm（直径）XI~80mm（长度）

0.3-1mm（直径）X1-50mm（长度）（长度是菌体两端点之间的距离，而非实际长度）

2、测量方法

显微镜测微尺

显微照相后根据放大倍数进行测算

〔二）大小

2、细菌大小测量结果的影响因素（参见P31）

个体差异；

枯燥、固定后的菌体会一般由于脱水而比活菌体缩短1/3-1/4：

染色方法的影响，一般用负染色法观察的菌体较大；

幼龄细菌一般比成熟的或老龄的细菌大；

环境条件，如培养基中渗透压的改变也会导致细胞大小的变化。

（三）细胞的结构

（见P39）

一般构造：一般细菌都有的构造

特殊构造：局部细菌具有的或般细菌在特殊环境下才有的构造

L细胞壁

1)概念：

细胞壁(cellwall)是位于细胞外表，内侧紧贴细胞膜的

一层较为坚韧，略具弹性的细胞结构。

2)证实细胞壁存在的方法：

(I)细菌超薄切片的电镜直接观察；

(2)质、壁别离与适当的染色，可以在光学显微镜下看到细胞壁;

13)机械法破裂细胞后，别离得到纯的细胞壁；

(4)制备原生质体，观察细胞形态的变化；

3)细胞壁的功能：(参见P38)

(1)固定细胞外形和提高机械强度；

(2)为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需；

(3)渗透屏障，阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质

1分子量大于800)进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、

消化酶和青霉素等有害物质的损伤；

(4)细菌特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的

敏感性的物质根底;

4)革兰氏染色与细胞壁：(参见P46)

(1)革兰氏染色

r简单染色法

正染色J「革兰氏染色法

IL鉴别染色法J抗酸性染色法

死菌j|芽抱染色法

JI负染色：荚膜染色法等姬姆萨染色法

细菌染色法j

I活菌：用美蓝或TTC(氧化三半基四氮理J等作活菌染色

(1)革兰氏染色

CGram1革兰)于1884年创造的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。

1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染

2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细胞间的相互作月从而使二者结合得更牢固。

3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保存在细胞内的为革兰氏阳性细菌，而革兰

氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细胞呈无色。

4,用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染，例如沙黄，它使原来无色的革兰氏阴性

细菌最后呈现桃红到红色，而革兰氏阳性细菌继续保持深紫色

表3-1革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁成分的比拟

(2)革兰氏阳性细菌的细胞壁

特点：厚度大(20-80nm)

化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸。

革兰氏阳性细菌的细胞壁｛肽聚糖(peptidoglycan)

磷壁酸(teichoicacid)

又称粘肽(mucopeptide)、胞壁质(murein)或粘质复合物(mucocomplex),是真细菌细胞壁中的特有成

分。

结合在革兰氏阳性细菌细胞壁上的一种酸性多糖

A、肽聚糖

厚约20〜80nm,由40层左右的网格状分子交织成的网套覆盖在整个细胞上,

双糖单位

原核生物所特有的己糖

图3-3革兰氏阳性细菌肽聚糖的立体结构(片段)

由四个氨基酸分子按L型与D型交替方式连接而成

双糖单位中的B-1,4-糖背键很容易被溶菌酶(lysozyme)所水解，从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的“散架”

而死亡。

目前所知的肽聚糖已超过10()和，在这一“肽聚糖的多样性”中，主要的变化发生在肽桥上。

B、磷壁酸

革兰氏阳性细菌细胞壁上特有的化学成分，主要成分为廿油瞬酸或核糖醇磷酸。

壁磷壁酸，它与肽聚糖分子间进行共价结合，含量会随培养基成分而改变,一般占细胞壁重量的10%,

有时可接近50%。用稀酸或稀碱可以提取。

跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的膜磷壁酸(又称脂磷壁酸)，由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂

正行共价结合后形成。其含量与培养条件关系不大。可用45%热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细

菌中提取。

主要生理功能：(参见P41)

细胞壁形成负电荷环境，增强细胞膜对二价阳离子的吸收；

二价阳离子，特别是高浓度的Mg2+o的存在，对于保持膜的硬度，提高细胞膜上需Mg2+的合成

能的活性极为重要。

贮藏磷元素；

增强某些致病菌对宿主细胞的模连、防止被白细胞吞噬以及抗补

体的作用；

革兰氏阳性细菌特异外表抗原的物质根底：I

噬菌体的特异性吸附受体；J可作为细菌分类、鉴定的依据

能调节细胞内自溶素(autolysin)的活力，防止细胞因自溶而死亡。

(3)革兰氏阴性细菌的细胞壁

肽聚糖

外膜

外膜蛋白

周质空间

A、肽聚糖(参见P4I)

埋藏在外膜层之内，是仅由1~2层肽聚糖网状分子组成的薄层(2~3nm),含量约占细胞壁总重的10%,

故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱。

内消旋二氨基庚二酸(m-DAP)(只在原核微生物细胞壁上发现)

没有特殊的肽桥，只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套

B、外膜(outermembrane)(参见P41)

位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等假设千种蛋白质组成的膜，有时也称

为外壁。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)

位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚(8~10nm)的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖

(corepolysaccharide)和0-特异侧链(0-specificsidechain,或称0-多糖或0-抗原)三局部组成。

脂多糖的主要功能

LPS结构的多变，决定了革兰氏阴性细菌细胞外表抗原决定簇的多样性；

根据LPS抗原性的测定，沙门氏菌属(SRw〃”⑷的抗原型多达2107种，一般都源自0-特异侧链种

类的变化。这种多变性是革兰氏阴性细菌躲避宿主免疫系统攻击，保持感染成功的重要手段。也可依此

用灵敏的血清学方法对病原菌进行鉴定，在传染病的诊断中有其重要意义。

LPS负电荷较强，与磷壁酸用似，也有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细胞外表浓度的作用，

对细胞膜结构起稳定作用。

类脂A是革兰氏阴性细菌致病物质一内毒素的物质根底；

具有控制某些物质进出细胞的局部选择性屏障功能；

许多噬菌体在细胞外表的吸附受体；

C、外膜蛋白(outermembraneprotein)

嵌合在LPS和磷脂层外膜上的蛋白。有20余种，但多数功能尚不清楚。

孔蛋白(porins)是由三个相同分子量(36000)蛋白亚基犯成的一种三聚体跨膜蛋白，中间有一直

径约Inm的孔道，通过孔的开、闭，可对进入外膜层的物质让行选择。

非特异性孔蛋白

可通过分子量小于800-900的任何亲水性分子

特异性孔蛋白

只容许一种或少数几种相关物质通过，如维生素B12和核甘酸等。

脂蛋白(lipoprotein)是一种通过共价键使外膜层牢固地连接在肽聚糖内壁层上的蛋白，分子量约为

7200o

D、周质空间(periplasmicspace,periplasm)

又称壁膜间隙。在革兰氏阴性细菌中，一般指其外膜与细胞膜之间的狭窄空间(宽约12-15nm),呈

胶状。

同质空间是进出细胞的物质的重要中转站和反响场所

在周质空间中，存在着多种周质蛋白(periplasmicproteins)

水解酶类；

合成酶类；

结合蛋白；

受体蛋白；

14)革兰氏阳性和阴性细菌的比拟

(参见P44,表3-2)

革兰氏染色的原理(参见P46)

5)特殊细胞壁的细菌：

某些分枝杆菌和诺卡氏菌的细胞壁主要由一类被称为霉菌酸

(Mycolicacid)的枝链珞基脂质组成，后者被认为与这些细

菌感染能力有关。

用抗酸性染色对宿主体内的分枝杆菌病原体进行检测

6)细胞壁缺陷细菌：(参见P46)

(缺壁突变——L型细菌

实验室或宿主体内形成根#去尽一原生埠体(G+)

缺壁细菌人工去壁I

局部去除——球状体(G-)

在自然界长期进化中形成——枝原体

(1)L型细菌(L-formofbacteria)

细菌在某些环境条件下(实验室或宿主体内〕通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异

型。

因英国李斯德(Lister)预防研究所首先发现而得名(1935年，念珠状链杆菌Streptohacillus

nionilifonnis)

大肠杆菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌、分枝杆菌和霍乱弧菌等20多种细菌中均有发现，被认为

可能与针对细胞壁的抗菌治疗有关。

特点：

没有完整而坚韧的细胞壁，细胞呈多形态；

有些能通过细菌滤器，故又称“滤过型细菌”；

对渗透敏感，在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落(直径在0.1mm左右)；

(2)原生质体(protoplast)

在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青斑素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一

层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。

特点：

对环境条件变化敏感，低渗透压、振荡、离心甚至通气等都易引起其破裂；

有的原生质体具有鞭毛，但不能运动，也不被相应噬菌体所感染；

在适宜条件(如高渗培养基)可生长繁殖、形成菌落，形成芽泡。及恢亚成有细胞壁的正常结构。

比正常有细胞壁的细菌更易导入外源遗传物质，是研究遗，’专规律和进行原生质体育种的良好实验材

料。

(3)球状体(sphaeroplast),又称原生质球

采用上述同样方法，针对革兰氏阴性细菌处理后而获得的残留局部细胞壁(外壁层)的球形体。与

原生质体相比，它对外界环境具有一定的抗性，可在普通培养基上生长。

(4)枝原体(Mycoplasma)

在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。因它的细胞膜中含有一般原

核牛.物所没有的笛醉，所以即使缺乏细胞壁,其细胞膜仍有较高的机械强度。

2、细胞膜

1)概念：

细胞质膜(cytoplasmicmembrane),又称质膜(plasmamembrane)细胞膜(cellmembrane)或内膜

(innermembrane),是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜,

厚约7〜8nm,由磷脂(占20%〜30%)和蛋白质(占50%〜70%)组成。

2)观察方法：

质壁别离后结合鉴别性染色在光学显微镜下观察；

原生质体破裂；

超薄切片电镜观察；

电镜观察到的细胞质膜，是在上下两暗色层之间夹着一浅色中间层的双层膜结构，这与细胞膜的化

学组成有关。

疏水的非极性端

3)细胞膜的化学组成与结构模型：

(1)磷脂(参见p47)

亲水的极性端r

在极性头的甘油3C上，不同种微生物具有不同

的R基，如磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷

脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇等。

非极性尾那么由长链脂肪酸通过酯键连接在甘

甘油-3-破段Kfi!胧肪酸

图3-10磷脂的分毛结构

油的Cl和C2位上组成，其链长和饱和度因细菌种类和生长温度而异。

在生理温度下，脂肪酸末端排列成固定的晶格。

不饱和脂肪酸的双键可导致模结构的变形。当磷脂分子中二者同时存在时，在一定条件下就阻碍了

形成晶格结构所需要的有秩序排列。

膜的流动性很大程度上取决于不饱和脂肪酸的结构和相对含量。细胞膜上长链脂肪酸的徒长和饱和

度因细菌种类和生长温度而异，通常生长温度要求越高的种，其饱和度也越高，反之那么低，

(2)膜蛋白

具运输功能的整合蛋白(intsgralprotein)或内嵌蛋白(intrinsicprotein)

具有酶促作用的周边蛋白(peripheralprotein)或膜外蛋白(extrinsicprotein)

膜蛋白约占细菌细胞膜的50%~70%,比任何一种生物膜都高，而且种类也多。-----细胞膜是一

个重要的代谢活动中心。

(3)液态镶嵌模型(fluidmosaicmodel)

①膜的主体是脂质双分子层；

②脂质双分子层具有流动性；

③整合蛋白因其外表呈疏水性，故可“溶”于脂质双分子层的疏水性内层中；

④周边蛋白外表含有亲水基闭，故可通过静电引力与脂质双分子层外表的极性头相连：

⑤脂质分子间或脂质与蛋白质分子间无共价结合；

⑥脂质双分子层犹如一“海洋”，周边蛋白可在其上作"漂浮''运动，而整合蛋白那么似“冰山”状沉浸在其

中作横向移动。

1972年,辛格0和尼科尔森0

(4)留醇类物质

由磷脂分子形成的双分子膜中参加曲醇类物质可以提高膜的稳定性

雷醇的一般结构

真核生物细胞膜中一般含有担固醇等俗醇，含量为5%-25%,

原核生物与真核生物的最大区别就是其细胞膜中•般不含胆固醇，而是含有hopanoid。

hopanoid类笛醒，其作用被认为也是稳定细胞膜的结构

90%的化石燃料的前体物质是kerogen(油原，或称油母岩质)

Kerogen中细菌特有的hopanoid类留醇占有很高的比例

Kerogen是由于细菌的活动而形成

在地卜.沉积物中细菌特有的hopanoid类笛醉的含量高达1011-12吨，与目前地球上

存在的活的生物(livingorganisms)体内含有的有机碳的含量总和相当。

hopanoid被认为是地球上含量最丰富的生物分子

4)细胞膜的生理功能：(参见P48)

①选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送；

②是维持细胞内正常渗透压的屏障；

③合成细胞壁和糖被的各种组分(肽聚糖、磷壁酸、LPS、英膜多糖等)的重要基地；

④膜上含有氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢的酷系，是细胞的产能场所；

⑤是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转的供能部位；

5)间体(mesosonie,或中体)：

细胞质膜内褶而形成的囊状构造，其中充满着层状或管状的泡囊。多见于革兰氏阳性细菌。

青霉素酶分泌、DNA复制、分配以及细胞分裂有关

“间体”仅是电镜制片时因脱水操作而引起的一种腰像

3、细胞质和内含物

1)概念：(参见P49)

细胞质(cytoplasm)是细胞质膜包围的除核区外的一切半透明、胶状、颗粒状物质的总称。含水量

约80%。

细胞质的主要成分为核糖体、贮藏物、多种酶类和中间代谢物、质粒、各种营养物和大分子的单体

等，少数细菌还有类囊体、竣酶体、气泡或伴胞晶体等。

2)颗粒状贮藏物(reservematerials)：

贮藏物是一类由不同化学成分累积而成的不溶性沉淀颗粒，主要功能是贮存营养物。

「糖原：大肠杆菌、克雷伯氏菌、芽抱杆菌和蓝细菌等

碳源及能色类聚B-羟丁酸固氮菌、产碱菌和肠杆菌等

硫粒：紫,细菌、丝硫细菌、〔贝氏硫杆菌等

贮藏物时青素：蓝细菌r

藻青蛋白；蓝细菌氮源类L

磷源(异鼠粒)：迂回螺菌、白喉棒杆菌、结核分枝杆菌

①聚-B-羟丁酸(poly-B-hydroxybutyrate,PHB)

类脂性质的碳源类贮藏物

巨大芽胞杆曲(及d〃〃s〃曲。心用〃扪在含乙酸或丁酸的培养基中生长时，细胞内贮藏的PHB可达

其干重的60%。

PHB于1929年被发现，至今已发现60属以上的细菌能合成并贮藏。

它无毒、可塑、易降解，被认为是生产医用塑料、生物降解塑料的良好原料

②多糖类贮藏物耐型粒

t淀粉粒

在真细菌中以糖原为多糖原粒较小，不染色需用电镜观察，用碘液染成褐色，可在光学显微镜下看

到。

有的细菌积累淀粉粒，用碘液染成深兰色。

③异染粒(metachromaticgranules)

颗粒大小为0.5〜1.0um,是无机偏磷酸的聚合物，一般在含磷丰富的环境下形成。功能是贮藏磷元

素和能量，并可降低细胞的渗透压。

④藻青素(cyanophycin)〔参见P49)

一种内源性氮源贮藏物，同时还兼有贮存能源的作用。通常存在于蓝细菌中。

由含精氨酸和天冬氨酸残基(1:1)的分枝多肽所构成，分子量在25000〜125000,

⑤硫粒(sulfurglobules)

很多真细菌在进行产能代谢或生物合成时，常涉及对复原性的硫化物如H2S,硫代硫酸盐等的氧化。

在环境中复原性硫素丰富时，常在细胞内以折光性很强的硫粒的形式积累硫元素。

当环境中环境中复原性硫缺乏时，可被细菌重新利用。

2)贮藏物(reservematerials)：

微生物储藏物的特点及生理功能：

不同微生物其储藏性内含物不同

(例如厌气性梭状芽泡杆菌只含PHB,大肠杆菌只储藏糖原，但有些光和细菌二者兼有I

微生物合理利用营养物质的一种调节方式

当环境中缺乏能源而碳源丰富时，细胞内就储藏较多的碳源类内含物，甚至到达细胞干重的50%,

如果把这样的细胞移入有氮的培养基时，这些储藏物将被作为碳源和能源而用于合成反响。

储藏物以多聚体的形式存在，有利于维持细胞内环境的平衡，

防止不适合的pH,渗透压等的危害。(例如羟基丁酸分子呈酸性，而当其聚合成聚-B-羟丁酸(PHB)

就成为中性脂肪酸了，这样便能维持细胞内中性环境，防止菌体内酸性增高。)

储藏物在细菌细胞中大量积累，还可以被人们利用。

3)磁小体(megnetosome)(参见P50)

趋磁细菌细胞中含有的大小均匀、数目不等的Fe3O4颗粒，外有一层磷脂、蛋白或糖蛋白膜包裹。

功能是导向作用，即借鞭毛游向对该菌最有利的泥、水界面微氧环境处生活。

实用前景，包括生产磁性定向药物或抗体，以及制造生物传感器等

4）竣能体（carboxysome）（参见P5I）

一些自养细菌细胞内的多角形或六角形内含物

其大小与噬菌体相仿，约lOnm,内含1,5-二磷酸核酮糖蔑化前，在自养细菌的CO2固定中起着关

键作用。

采用免疫电镜技术观察蓝细菌cyanobacteriumChlorogloeopsisfritischii中的竣前体

5）气泡Igasvocuoles）（参见P51）

许多光合营养型、无鞭毛运动的水生细菌中存在的充满气体的泡囊状内含物，大小为0.2〜l.Oum

X75nm,内由数排柱形小空泡组成，外有2nm厚的蛋白质膜包裹。

功能：调节细胞比重以使细胞漂浮在最适水层中获取光能、02和营养物质

专性好氧的盐杆菌属tHalobacterium｝的细菌，却生活在含氧极少的饱和盐水中，它们细胞中气泡

显著，其作用被认为是使菌体浮于盐水外表，以保证细胞更接近空气。

有些厌氧性光和细菌利用气泡集中在水下10-30米深处，这样既能吸收适宜的光线和营养进行光和

作用，又可以防止直接与氧接触。

蓝细菌生长时依靠细胞内的气泡而漂浮于湖水外表，并随风聚集成块，常使湖内出现“水花”。

气泡的膜只含蛋白质而无磷脂。二种蛋白质相互交连，形成一个坚硬的结构，可耐受一定的压力。

膜的外外表亲水，而内侧绝对疏水，故气泡只能透气而不能透过水和溶质。

6）载色体（Chromalophore）

光和细菌进行光和作用的部位相当于绿色植物的叶绿体

7）核糖体（ribosome）

略

8）质粒（plasmid）

移到第八章“微生物遗传”

4.核区（nuclearregionorarea）（参见P51）

原核生物所特有的无核膜结构、无固定形态的原始细胞核

5、特殊的休眠构造——芽m（参见P5i）

1）概念

某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的

休眠体，称为芽抱（endosporespore,偶译“内生胞子

2）细菌芽胞的特点

整个生物界中抗逆性最强的生命体，是否能消灭芽也是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。

芽胞是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞；产芽抱细菌的保藏多用其芽

血

产芽抱的细菌多为杆菌，也有一些球菌。芽抱的有无、形态、大小和看生位置是细菌分类和鉴定中

的重要指标。

芽胞与营养细胞相比化学组成存在较大差异，容易在光学显微镜下观察。（相差显微镜直接观察；芽

施染色）

3）芽胞的形成与芽泡的萌发过程（参见P53-54）

4）芽泡的耐热机制（参见P55）

芽抱与母细胞相比不管化学组成、细微结构、生理功能等方面都完全不同［表3-3）

渗透调节皮层膨胀学说

芽抱衣对多价阳离子和水分的透性很差

皮层的离子强度很高，产生极高的渗透压夺取芽抱核心的水分，结果造成皮层的充分膨胀。

核心局部的细胞质却变得百度失水，因此，具极强的耐热性。

5）芽泡杆菌（BaciHus）芽胞形成的生理调控

Transition_________-/、启动芽抱形成

QGeAspoO簇基因A

感受态建立

表达稳定期的基因

（例如胞外蛋白酶）

6）伴衔晶体（paraspomlcrystal）［参见P56）

少数芽泡杆菌，例如苏云金芽胞杆菌（8ac〃/"s加山〃gie/?sis）在其形成芽抱的同时，会在芽抱旁形成'

颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体——6内毒素，称为伴抱晶体。

特点：不溶于水，对蛋白酶类不敏感；容易溶于碱性溶剂。

伴胞晶体对20（）多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用.因而可将这类产伴抱晶体的细菌制成有

利于环境保护的生物农药——细菌杀虫剂。

伴抱晶体

鳞翅目幼虫口服

伴硝晶体在肠道迅速溶解（中肠pH为）

吸附于上皮细胞，引起渗透性丧失，肠道穿孔

肠道中的碱性溶液进入血液，后者pH升高，昆虫全身麻痹而死亡

7）细菌的其他休眠构造（参见P56）

6、细菌细胞壁以外的构造------糖被（glycocalyx）（详见P57）

1）概念

包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质。糖被按其有无固定层次、层次厚薄又可细分

为荚膜（capsule或macrocapsule.大荚膜）、微荚膜（microcapsule）、粘液层（slimelayer）和菌胶团（zoogloea）。

粘液层

荚膜

菌股团

2）特点（详见P57-58）

（1）主要成分是多糖、多肽或蛋白质，尤以多糖居多。

经特殊的荚膜染色，特