荧光知识测试题目与答案

荧光知识测试题目与答案考试时间：______分钟总分：______分姓名：______一、选择题（请选出最符合题意的选项）1.当物质吸收光能后，其最低激发单重态与最高发射单重态之间存在能量差，这个能量差主要转化为哪种形式的能量释放？A.热能B.荧光C.磷光D.激光2.斯托克斯位移是指什么现象？A.荧光波长大于激发波长B.荧光波长小于激发波长C.荧光强度随时间衰减D.荧光寿命随温度增加而延长3.下列哪种物质通常被认为是典型的荧光分子？A.碳纳米管B.量子点C.菲D.金纳米颗粒4.能使荧光强度下降，但荧光光谱形状不发生改变的因素是？A.激发波长变化B.荧光物质浓度增加C.加入荧光猝灭剂D.提高环境温度5.与荧光相比，磷光的显著特点是什么？A.发射波长更短B.发射波长更长C.发射速率更快D.发射光颜色更纯6.在荧光光谱法中，选择合适的激发波长通常基于什么原则？A.激发波长应尽可能短B.激发波长应使样品对环境散射最小C.激发波长应使样品的吸收最大D.激发波长应与发射波长完全相同7.下列哪种效应会导致荧光分子与溶剂分子相互作用，从而影响荧光强度和光谱？A.内滤光效应B.外滤光效应C.折射率变化D.溶剂效应8.用于标记生物大分子（如蛋白质、核酸）进行可视化观察的荧光探针，通常需要具备哪些特性？A.高荧光量子产率B.良好的细胞穿透性C.对靶标分子具有特异性结合D.以上都是9.在生物样品中，哪些因素可能导致荧光信号干扰？A.自发荧光B.黄疸C.荧光淬灭D.以上都是10.下列哪种荧光分析技术常用于测量荧光寿命，以获得关于荧光团微环境的信息？A.荧光光谱法B.荧光偏振法C.脉冲荧光法D.相位荧光法二、选择题（请选出所有符合题意的选项）1.下列哪些属于荧光猝灭的主要机制？A.系间窜越B.溶剂猝灭C.自吸光D.化学反应2.量子点作为荧光探针，相比有机荧光染料，其主要优势包括？A.荧光量子产率高B.荧光发射波长可调范围广C.光稳定性好D.生物相容性好3.荧光免疫分析技术主要包括哪些类型？A.免疫荧光技术B.时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)C.荧光偏振免疫测定D.流式细胞术中的免疫荧光检测4.影响荧光共振能量转移(FRET)效率的主要因素有哪些？A.能量供体和受体分子间的距离B.供体和受体的相对取向C.环境因素（如溶剂极性）D.发射光谱的重叠程度5.荧光在以下哪些领域有重要应用？A.生物医学诊断B.化学品检测C.材料表征D.环境监测E.物质结构解析6.常见的荧光猝灭剂有哪些？A.重金属离子(如Cu²⁺,Fe³⁺)B.超分子受体(如轮状聚糖)C.氧气D.脂溶性染料7.下列哪些是常见的荧光标记技术？A.直接荧光标记B.间接荧光标记C.原位荧光标记D.双标记技术8.量子点在生物成像中的应用优势包括？A.可见光及近红外区域发射B.高亮度和良好的光稳定性C.尺寸效应导致的光学特性可调D.可实现多色成像9.荧光分析法相比其他光谱分析法（如紫外-可见吸收光谱法），其主要特点有哪些？A.灵敏度高B.选择性好C.可实现标记检测D.通常需要破坏样品10.荧光寿命测量技术可以用来研究什么？A.荧光团的结构变化B.荧光团所处的微环境C.大分子间的相互作用D.发光物质的浓度分布三、填空题1.荧光量子产率(Φf)是衡量荧光物质发光效率的物理量，其定义为________与________的比值。2.斯托克斯位移(Δλ)通常定义为________与________的差值，其值一般不为零的原因主要是________。3.能级交叉效应是指激发态分子通过________过程，从较低激发单重态直接跃迁到较高激发单重态的现象。4.荧光猝灭是指荧光物质在某种因素影响下，其荧光强度________的现象。5.在荧光偏振免疫分析中，通过测量荧光的________和________，可以提高测定的特异性，减少非特异性结合的干扰。6.量子点是由________和________原子构成的半导体纳米晶体，其光学特性（如荧光波长）主要取决于________。7.荧光共振能量转移(FRET)是指处于激发态的供体分子通过________，将其部分能量无辐射地转移给邻近的受体分子，导致供体荧光减弱、受体发光增强的现象。8.在进行荧光定量分析时，为了获得线性响应范围，通常需要满足________条件，即荧光强度(F)与荧光物质浓度(c)在一定范围内成正比关系。9.常用的荧光quencher包括________、________和某些大分子或生物分子。10.荧光显微镜是利用________对样品进行成像的显微镜技术，可以观察到细胞或组织内的________和________。四、简答题1.简述影响荧光强度的因素有哪些，并解释其影响机理。2.区分荧光和磷光的主要区别是什么？并简述产生磷光的主要条件。3.解释什么是荧光猝灭，并列举常见的三种荧光猝灭机制及其简要原理。4.简述荧光免疫分析的基本原理，并说明直接法与间接法的区别。5.简述量子点作为荧光探针的主要优势和潜在缺点。五、论述题1.结合实例，论述荧光技术在生物医学领域的应用，例如在疾病诊断、药物筛选或生命科学研究中的作用。2.如何克服生物样品中自发荧光和荧光淬灭带来的干扰，以提高荧光分析方法的准确性和灵敏度？请提出几种可能的策略并简述其原理。试卷答案一、选择题（请选出最符合题意的选项）1.B解析：物质吸收光能后，电子跃迁到激发态，随后从激发态返回基态的过程中，能量会以光辐射（荧光）或其他形式（如热能）释放。荧光是主要的能量释放形式之一。2.A解析：斯托克斯位移定义为荧光发射波长(λem)与激发波长(λex)之差(λem-λex)。由于振动弛豫等原因，发射光子能量总是低于吸收光子能量，因此荧光波长总是大于激发波长。3.C解析：菲(Fluorene)是一种典型的芳香族碳氢化合物，具有明显的荧光特性，常被用作研究荧光现象的模型分子。碳纳米管和量子点也可发光，但通常不归为典型的荧光分子。金纳米颗粒主要表现为表面等离子体共振散射。4.C解析：荧光猝灭是指荧光强度下降的过程。动态猝灭（如分子碰撞猝灭）或静态猝灭（形成非荧光络合物）会降低荧光量子产率，从而降低荧光强度。然而，这些过程通常不改变荧光发射光谱的形状，除非猝灭剂与荧光分子发生结构变化。浓度增加可能引起自吸光，轻微改变光谱形状。激发波长和温度主要影响荧光强度和光谱位置，而非光谱形状本身。5.B解析：磷光是指分子在激发态回到基态的过程中，通过系间窜越进入激发三重态，然后从激发三重态跃迁回基态时发射的光。从三重态回到基态的能级差通常小于单重态，因此磷光发射波长通常比荧光更长。6.C解析：选择合适的激发波长应使样品在该波长下具有最大的吸收系数，从而能被最大程度地激发，提高检测灵敏度和信号强度。7.D解析：溶剂效应是指荧光物质分子与其周围溶剂分子之间的相互作用会影响荧光分子的电子结构和能级，进而影响其吸收光谱和发射光谱（强度和波长）。8.D解析：用于生物标记的荧光探针需要具备高量子产率（确保信号强度）、良好的细胞穿透性（能进入细胞或组织）、对靶标分子特异性结合（确保信号定位准确）以及良好的生物相容性（不影响细胞活性）。以上都是其应具备的重要特性。9.D解析：生物样品中的自发荧光（样品本身发射荧光）、黄疸（胆红素等黄色物质干扰）和荧光淬灭（如金属离子、氧气、大分子quencher干扰）都会对测量产生干扰。10.C解析：脉冲荧光法通过测量荧光分子在短时间脉冲激发下的荧光衰减曲线，可以直接得到荧光寿命信息。相位荧光法也是测量荧光寿命的技术之一，但脉冲法更直接。荧光光谱法和荧光偏振法主要用于测量荧光强度和偏振状态，不直接测量寿命。二、选择题（请选出所有符合题意的选项）1.A,B,C,D解析：系间窜越(IntersystemCrossing,ISC)是激发单重态向激发三重态的跃迁，不发射荧光，相当于一种猝灭过程。溶剂猝灭是溶剂分子与激发态分子相互作用导致的能量损失或非辐射跃迁。自吸光(Self-absorption)是发射光被样品自身吸收的现象，降低了到达检测器的荧光强度。化学反应是猝灭剂与荧光分子发生反应生成非荧光物质。2.A,B,C解析：量子点具有高荧光量子产率（可通过选择材料和表面修饰提高）、荧光发射波长可通过尺寸调节在可见光到近红外区域连续可调，且具有优良的光稳定性和化学稳定性。但它们通常需要表面修饰以提高生物相容性，并非天然具有优异的生物相容性。3.A,B,C,D解析：免疫荧光技术（直接或间接法）、时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)、荧光偏振免疫测定以及流式细胞术中的免疫荧光检测都属于荧光免疫分析技术的范畴。4.A,B,C,D解析：根据FRET理论，能量转移效率与供体和受体间距离的六次方成反比，与相对取向有关（需要部分重叠），还受到环境因素（如溶剂极性可影响偶极矩取向）和供体发射光谱与受体吸收光谱重叠程度的影响。5.A,B,C,D,E解析：荧光技术广泛应用于生物医学诊断（如流式细胞术、免疫荧光检测）、化学检测（如环境污染物监测、药物筛选）、材料表征（如半导体量子点、聚合物发光材料）、环境监测（如水质检测）以及物质结构解析（如分子构象研究、三维成像）等众多领域。6.A,C,D解析：重金属离子（如Cu²⁺,Fe³⁺等）可通过配位作用或产生单线态氧来猝灭荧光。氧气是常见的物理猝灭剂（单线态氧淬灭）。脂溶性染料（如Iodide离子）可通过形成激基复合物来猝灭。7.A,B,C,D解析：直接荧光标记是将荧光染料直接与目标分子共价连接。间接荧光标记是先用特异性结合分子（如抗体）结合目标物，再用荧光标记的二级试剂结合结合分子。原位荧光标记是在生物组织或细胞内直接标记目标物。双标记技术是用两种不同荧光颜色的探针标记不同的目标物或同一目标物的不同位点。8.A,B,C,D解析：量子点可在可见光及近红外区域发出荧光（A），具有高亮度和良好的光稳定性（B），其光学特性（如荧光峰位、半峰宽）随尺寸变化（尺寸效应），可实现多色成像（D）。9.A,B,C解析：荧光分析通常比紫外-可见吸收光谱法更灵敏（A），因为荧光检测的是发射光，信号更强。选择性好（B），因为可以利用发射光谱的特异性进行检测。可实现标记检测（C），方便对生物分子进行追踪和分析。荧光分析通常不破坏样品（D），且样品前处理相对简单。10.A,B,C解析：荧光寿命是荧光衰减到初始值的1/e所需的时间，它对荧光团所处的微环境（如溶剂粘度、周围基团极性、分子内电荷转移等）非常敏感。因此，通过测量荧光寿命可以研究荧光团的结构变化（A）、所处的微环境（B）以及大分子间的相互作用（如结合引起的微环境变化）（C)。它通常不直接反映浓度分布（D），更适用于研究动态过程或微环境变化。三、填空题1.荧光强度衰减至初始值的1/e时所需的时间(τf)/荧光强度衰减曲线/荧光衰减函数；吸收的光强度(Φa)解析：荧光量子产率Φf=Φf/Φa，其中Φf是发射的光子数，Φa是吸收的光子数。2.荧光发射最大波长；激发最大波长；振动弛豫/多重振动弛豫解析：斯托克斯位移Δλ=λem(max)-λex(max)。发射光子能量低于吸收光子能量，主要原因是发射前分子会经历振动弛豫，将部分能量转化为热能。3.系间窜越(IntersystemCrossing,ISC)解析：系间窜越是激发态分子从基态的singlet态通过允许跃迁（ΔS=0）到达triplet态的过程。4.降低/消失解析：荧光猝灭定义为荧光强度相对于无猝灭剂存在时强度的下降。5.垂直分量；水平分量解析：荧光偏振免疫分析利用偏振片选择特定偏振方向的激发光和发射光。非特异性结合产生的荧光信号通常是无规偏振的，会被偏振片滤除，而特异性结合位点处的荧光信号可能因抗原抗体构象等因素而具有特定的偏振方向，从而能够被检测到。测量垂直和水平偏振发射光强的差异（或比率）可以提高特异性。6.半导体；半导体；尺寸解析：量子点本质上是半导体纳米晶体，其光学性质（如带隙、荧光波长）主要依赖于构成晶体的半导体材料（如CdSe,InP等）以及晶粒的大小（尺寸效应）。7.无辐射能量转移(Non-radiativeEnergyTransfer,NRET)解析：FRET是一种通过电磁偶极相互作用，将激发态供体分子的能量无辐射地转移给邻近的受体分子的过程。8.线性范围/稀释系列/贝尔定律(Beer'sLaw)条件解析：根据朗伯-比尔定律，当激发光源强度恒定、仪器响应线性时，荧光强度F与荧光物质浓度c成正比(F=k'*c)，这个关系成立的浓度范围就是线性响应范围。通常需要配制一系列已知浓度的标准样品，绘制F-c曲线来确定该范围。9.氧气；重金属离子(如Cu²⁺,Fe³⁺);大分子或生物分子(如蛋白质、核酸)解析：常见的荧光猝灭剂包括氧气（通过产生单线态氧猝灭）、重金属离子（如Cu²⁺,Fe³⁺等，可通过配位或产生单线态氧猝灭）以及一些大分子或生物分子（如某些氨基酸、生物碱等）。10.荧光/发荧光物质；荧光标记的细胞/组织结构；荧光标记的特定分子或事件解析：荧光显微镜利用荧光物质在特定波长激发下发出可见光进行成像。通过选择不同荧光颜色的探针，可以观察到细胞或组织内的三维结构、特定细胞器、荧光标记的蛋白质、DNA/RNA等以及各种生命活动事件。四、简答题1.简述影响荧光强度的因素有哪些，并解释其影响机理。答：影响荧光强度的因素主要有：*荧光物质浓度：在稀溶液范围内，荧光强度(F)与荧光物质浓度(c)成正比(F=k'*c)，遵循朗伯-比尔定律。浓度过高时，会发生自吸光，导致荧光强度下降。*激发波长和强度：荧光强度与激发波长成正比（在吸收峰附近）。激发强度越大，激发的光子数越多，产生的荧光强度也越高。*温度：温度升高通常会增加分子运动，促进无辐射跃迁（如振动弛豫），导致荧光强度下降，荧光寿命缩短。*溶剂效应：溶剂的极性、粘度等会影响荧光分子的激发态能级、振动寿命和分子间相互作用，从而影响荧光强度和光谱。*pH值：对于含有可解离基团的荧光分子，pH值的改变会改变其分子结构，进而影响其荧光强度。*荧光猝灭：任何能够使荧光分子从激发态以非辐射方式失活的因素都会导致荧光强度下降，如氧气、重金属离子、某些有机分子等。*内滤光效应：荧光分子本身对发射光谱波长的光有吸收，导致到达检测器的荧光强度减弱。*外滤光效应：样品容器、光学元件或环境中的杂质对发射光谱波长的光有吸收或散射，导致到达检测器的荧光强度减弱。2.区分荧光和磷光的主要区别是什么？并简述产生磷光的主要条件。答：荧光和磷光的主要区别在于：*发射波长：荧光发射波长通常比激发波长短(λem<λex)，而磷光发射波长通常比激发波长长(λem>λex)。*发射过程：荧光发射是激发态分子从单重态(SingletState)返回基态(GroundState)时发生的，而磷光发射是激发态分子从三重态(TripletState)返回基态时发生的。*发射光谱：荧光光谱通常较宽，而磷光光谱通常较窄。*荧光寿命：荧光寿命通常很短，在纳秒到微秒级别，而磷光寿命通常很长，在毫秒到秒甚至更长。*影响因素：荧光易受氧、温度等因素影响，而磷光相对稳定，不易受氧影响，但易受温度影响。*应用：荧光应用更广泛，检测条件要求相对宽松；磷光检测需要苛刻的无氧条件（如惰性气体保护、液氮冷却）。产生磷光的主要条件是：*必须发生系间窜越(ISC)：激发态分子必须通过允许跃迁（ΔS=0）从基态的singlet态到达激发三重态(tripletexcitedstate)。不是所有分子都能发生ISC，这取决于分子的对称性（需要非对称中心或手性分子）。*激发态分子需要与基态存在能级差：三重态与单重态基态之间存在一定的能级差，这个能级差对应于磷光的发射波长。*需要避免非辐射跃迁回到基态：由于三重态与单重态自旋状态不同，不允许发生系间窜越回到单重态基态，分子只能通过发射光子（磷光）或通过分子内其他途径（如分子内质子转移）回到单重态基态，然后单重态基态再通过正常途径衰减。如果三重态可以通过快速非辐射跃迁回到基态，则不会观察到磷光。3.解释什么是荧光猝灭，并列举常见的三种荧光猝灭机制及其简要原理。答：荧光猝灭是指荧光物质在某种因素（猝灭剂或环境条件）的影响下，其荧光强度下降的现象。这些因素导致激发态分子以非辐射方式失活，能量转化为热能或其他形式，从而减少了发射光子的数量。常见的荧光猝灭机制有：*动态猝灭(DynamicQuenching)：激发态荧光分子与猝灭剂分子发生快速碰撞，发生能量交换或化学反应，使荧光分子回到基态。例如，氧气与激发态分子碰撞生成单线态氧，导致猝灭。*静态猝灭(StaticQuenching)：猝灭剂与荧光分子在基态或激发态发生反应，生成无荧光或荧光极弱的络合物或加合物。例如，重金属离子（如Cu²⁺,Fe³⁺）与荧光染料形成不发光的络合物。*静态猝灭(或称系间窜越猝灭增强)：对于某些分子，存在从激发单重态通过系间窜越(ISC)到达激发三重态的途径。如果三重态与单重态基态之间的能级差较小，或者三重态可以通过快速非辐射跃迁回到基态，或者三重态的寿命较长，则分子主要发射磷光而不是荧光。虽然机理不完全等同于典型的动态或静态猝灭，但结果也是导致单重态荧光强度下降。4.简述荧光免疫分析的基本原理，并说明直接法与间接法的区别。答：荧光免疫分析是基于抗原抗体之间特异性的结合反应，利用荧光标记物对反应进行检测的一种免疫分析方法。其基本原理是：将抗体或抗原标记上荧光染料，与样品中的待测抗原或抗体反应，形成抗原抗体复合物。然后，通过荧光检测仪器测量复合物上荧光标记发出的荧光信号强度，从而实现对待测抗原或抗体的定量或定性分析。直接法与间接法的区别：*直接法(DirectImmunoassay)：将荧光标记物直接连接到待测的抗体（直接法测抗原）或抗原（直接法测抗体）上。然后，将标记好的抗体/抗原与样品中的抗原/抗体结合。最后，直接检测结合物上的荧光信号。优点是步骤少，速度快；缺点是如果标记物与抗体/抗原结合不牢固或结合位点影响后续反应，可能影响灵敏度。*间接法(IndirectImmunoassay)：将未标记的抗体（间接法测抗原）或抗原（间接法测抗体）与样品反应，使待测抗原/抗体结合。然后，加入荧光标记的二抗（如果测抗原）或标记的二抗（如果测抗体，二抗特异性识别未标记的一抗）。最后，检测结合的二抗上的荧光信号。优点是灵敏度通常比直接法高，因为使用了亲和力更强的二抗；缺点是步骤更多，耗时较长，可能存在交叉反应或非特异性结合的干扰。5.简述量子点作为荧光探针的主要优势和潜在缺点。答：量子点作为荧光探针的主要优势：*高荧光量子产率：现代量子点可以通过合成和表面修饰达到很高的荧光量子产率，提供强烈的荧光信号。*宽光谱范围：可在紫外到近红外(NIR)区域发射荧光，且发射波长可通过尺寸调节连续变化，便于多色成像和选择合适的激发光源，减少生物组织的自发荧光和散射干扰。*光稳定性好：量子点具有优异的光稳定性，不易受光漂白影响，适合长时间成像和测量。*化学稳定性高：经过良好表面修饰的量子点具有良好的化学稳定性，可在复杂的生物环境中稳定存在。*易于功能化：量子点表面可以通过多种化学方法进行修饰，连接各种生物分子（如抗体、适配体、适配子）或染料分子，方便进行标记和靶向。量子点作为荧光探针的潜在缺点：*潜在的细胞毒性：量子点本身（尤其是未修饰或修饰不当的）可能具有细胞毒性，需要进行严格的表面修饰和细胞实验评估其生物相容性。*生物相容性问题：即使经过修饰，量子点能否完全避免体内积累和潜在的长期毒性仍需关注。*表面猝灭：量子点表面的缺陷或与表面配体的相互作用可能导致荧光猝灭，影响信号强度。*重金属成分：常见的Cd量子点含有重金属Cd，存在潜在的环境和健康风险，开发Cd-free或低毒性量子点是研究热点。*量子产率并非总是最高：虽然量子点量子产率可以很高，但某些情况下仍可能低于某些有机染料。五、论述题1.结合实例，论述荧光技术在生物医学领域的应用，例如在疾病诊断、药物筛选或生命科学研究中的作用。答：荧光技术因其高灵敏度、高特异性和可视化能力，在生物医学领域发挥着越来越重要的作用。*疾病诊断：*细胞成像：利用荧光标记的抗体、染料或探针，可以在显微镜下观察活细胞内的结构（如细胞器、线粒体）、分子（如蛋白质、DNA/RNA）和动态过程（如细胞分裂、信号传导）。例如，使用绿色荧光蛋白(GFP)或其变体标记特定蛋白，观察其在细胞内的定位和运动。利用活细胞染料（如H2DCFDA检测活性氧，CalceinAM检测细胞内Ca²⁺）监测细胞生理状态。*流式细胞术：通过激发不同颜色的荧光标记物，可以同时检测细胞多个参数（如细胞周期、细胞凋亡、多种表面标志物或内源性荧光），对大量细胞进行快速分析和分选，广泛应用于免疫学、肿瘤学、血液学等领域。例如，检测肿瘤细胞表面标志物（如CD19）的荧光强度和细胞数量，评估肿瘤负荷。*免疫荧光/化学：利用荧光标记的二抗或抗体，检测组织切片或细胞中的特定抗原，进行定性或半定量分析。例如，在石蜡切片上使用荧光免疫组化(FISH)检测肿瘤组织中的特定基因突变蛋白表达。*分子诊断：荧光探针可用于检测核酸序列、微小残留病灶等。例如，使用荧光分子信标(MolecularBeacon)检测特定mRNA序列。*药物筛选：*高通量筛选(HTS)：利用荧光读数（如荧光共振能量转移(FRET)、荧光强度变化、荧光寿命变化）监测药物与靶点（如酶、受体）的相互作用或对细胞功能的影响。例如，设计一个FRET药物筛选系统，当药物结合到靶点后，会引起FRET效率的变化，通过检测荧光信号变化来筛选活性化合物。*药物代谢和分布研究：利用荧光标记的药物分子，通过活体荧光成像技术（如生物发光成像、荧光成像）研究药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)过程。*药物作用机制研究：通过观察荧光标记药物对细胞内信号通路、蛋白相互作用或细胞结构的影响，研究药物的作用机制。*生命科学研究：*动态过程成像：荧光技术是研究细胞生命活动动态过程的强大工具。例如，利用荧光标记的pH探针或离子探针研究细胞内pH值或离子浓度的变化；利用荧光共振能量转移(FRET)技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。*结构生物学：荧光相关技术（如FRET、荧光光谱）可用于研究蛋白质的结构变化、动力学性质和分子识别过程。例如，利用FRET技术研究蛋白质构象的变化。*基因表达调控研究：利用荧光报告基因（如报告基因启动子连接荧光蛋白基因）监测基因表达水平的变化。2.如何克服生物样品中自发荧光和荧光淬灭带来的干扰，以提高荧光分析方法的准确性和灵敏度？请提出几种可能的策略并简述其原理。答：生物样品（如血液、组织、细胞培养液）中常存在自发荧光和荧光淬灭，会对荧光定量分析造成干扰，降低准确性和灵敏度。以下是一些克服这些干扰的策略及其原理：*选择合适的激发和发射波长：*原理：利用适当的激发和发射滤光片，选择远离样品自发荧光发射峰的激发波长，或选择在样品自发荧光发射峰之外进行检测。同时，选择能够最大程度地减少样品对发射光吸收的检测波长。斯托克斯位移越大，样品自身吸收的影响越小。*应用：例如，在检测具有较强自发荧光的样品（如血液）时，常选择近红外激发光源（如700nm以上），此时样品对激发光和发射光的吸收都较弱。*使用内标法(InternalStandard,IS)：*原理：在样品中加入一种与待测物物理化学性质相似，但在样品基