NYT 4658-2025 动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程标准立项发展报告

动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:TechnicalCodeofPracticeforIsolationandIdentificationof*Haemophilusparasuis*fromAnimalOrigin摘要副猪嗜血杆菌（*Haemophilusparasuis*）是引起猪革拉泽氏病（Glässer'sdisease）的主要病原体，该病以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征，给全球养猪业造成重大经济损失。近年来，随着我国生猪养殖规模化和集约化程度不断提高，副猪嗜血杆菌的感染率和危害程度呈上升趋势，其血清型众多、致病机制复杂、临床诊断困难等问题日益凸显，对标准化、规范化的病原分离与鉴定技术提出了迫切需求。在此背景下，农业行业标准NY/T4658-2025《动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程》于2025年1月9日发布，将于2025年5月1日正式实施。本报告系统梳理了该标准的立项背景、编制过程、核心技术内容及其行业意义，分析了当前副猪嗜血杆菌检测技术的最新进展和标准实施面临的机遇与挑战。该标准的发布填补了我国动物源副猪嗜血杆菌分离鉴定领域行业标准的空白，对于规范检测流程、提高检测准确性、保障生猪产业健康发展、维护动物源性食品安全具有重要意义。报告还对标准实施后的推广应用和后续修订方向提出了展望与建议。关键词：副猪嗜血杆菌；分离鉴定；农业行业标准；NY/T4658-2025；革拉泽氏病；猪呼吸道疾病；生物安全Keywords：*Haemophilusparasuis*;IsolationandIdentification;AgriculturalIndustryStandard;NY/T4658-2025;Glässer'sDisease;PorcineRespiratoryDisease;Biosafety一、引言副猪嗜血杆菌为巴斯德菌科（Pasteurellaceae）嗜血杆菌属成员，是一种革兰氏阴性、NAD依赖性、多形态的细小杆菌。该病原体作为猪上呼吸道正常菌群的一部分，在特定条件下可侵入机体引发系统性感染，导致以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要病理特征的革拉泽氏病。自1910年Glässer首次描述该病以来，副猪嗜血杆菌已成为全球养猪生产中最重要的细菌性病原之一。当前，副猪嗜血杆菌至少已鉴定出15种血清型及大量不可分型菌株，不同血清型之间的致病性和免疫原性差异显著，且各血清型间缺乏有效的交叉保护力。在中国，血清4型、5型、12型和13型为优势流行血清型，但不同地区、不同养殖模式下的血清型分布呈现动态变化。这种高度的血清学多样性使得疫苗防控效果不稳定，诊断和防控工作面临巨大挑战。此外，副猪嗜血杆菌常与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪链球菌等病原混合感染，进一步加剧了临床诊断和防控的难度。近年来，我国生猪养殖业加速向规模化、标准化方向转型，生猪调运频繁，疫病跨区域传播风险加大，副猪嗜血杆菌病的防控形势日趋严峻。然而，长期以来，我国缺乏统一的副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术行业标准，各检测机构和实验室在样本采集、细菌分离、鉴定方法、结果判定等环节操作不一，导致检测结果可比性差、误诊漏诊率偏高，严重制约了该病的科学防控和精准施策。为进一步规范动物源副猪嗜血杆菌的实验室检测技术，提升检测结果的准确性和一致性，支撑兽药残留监控、动物疫病净化和食品安全风险监测等工作，国家相关部门组织制定了农业行业标准NY/T4658-2025《动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程》。本报告就该标准的立项背景、编制原则与依据、核心技术要点、编制单位情况等方面进行系统阐述，并对标准的实施前景作出展望。二、标准编制背景与必要性（一）产业发展需求在当前"稳产保供"政策背景下，做好生猪疫病防控、降低发病率和死亡率，是保障生猪供给能力、稳定猪肉市场供应的重要基础。标准化、规范化的病原检测技术是疫病早发现、早诊断、早处置的前提条件。（二）现行标准与规范存在的不足在NY/T4658-2025发布之前，副猪嗜血杆菌的分离鉴定在我国主要参照以下文件执行：一是《中华人民共和国兽药典》中相关细菌学检验的通用要求；二是部分科研机构内部制定的操作规程；三是参考国外标准（如OIE《陆生动物诊断试验与疫苗手册》中的相关章节）。上述依据在不同层面均存在一定的适用局限：1.针对性不足：兽药典和OIE手册中的方法偏重于通用细菌学检测原则，未就副猪嗜血杆菌的特殊培养要求（如NAD依赖性、卫星生长现象等）作出专门和详尽规定。实际上，副猪嗜血杆菌对营养要求极为苛刻，其分离培养需要巧克力琼脂或含NAD的培养基，且标本采集、运输环节的时效性要求极高，细菌在体外存活时间有限，通用方法难以满足特异性和敏感性要求。2.操作细节不统一：不同实验室在样本采集部位（如浆膜渗出液、关节液、脑脊液、肺组织等）、采集工具、运输培养基选择、分离培养温度与气体环境、鉴定方法（生化鉴定、卫星试验、PCR等）及结果判定标准等方面均存在明显差异，导致检测结果的一致性差，不利于区域间数据共享和疫情比较分析。3.缺乏规范化质量控制要求：既有依据文件对抗菌药物敏感性试验方法、阳性对照菌株的选择、培养基质量控制、实验室生物安全要求等缺乏统一规定，难以保证检测结果的科学性和可重复性。（三）政策法规与标准化战略要求《中华人民共和国动物防疫法》（2021年修订）明确要求加强动物疫病检测诊断标准化建设，推动形成科学完善的动物疫病防控技术标准体系。2021年，农业农村部印发《全国动植物保护能力提升工程建设规划（2017—2025年）》，强调完善动物疫病监测预警体系，增强重大动物疫病检测诊断能力。同时，《国家标准化发展纲要》明确提出"筑牢动物疫病防控标准体系，提升食品安全保障水平"的目标要求。在此政策背景下，制定副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程既是贯彻国家标准化战略的具体举措，也是完善兽医公共卫生标准体系的重要环节。三、标准编制原则与依据（一）编制原则NY/T4658-2025在编制过程中严格遵循以下原则：1.科学性：以国内外最新研究成果为基础，充分吸收OIE推荐方法、国内外权威实验室的成熟检测技术，确保标准内容反映当前技术水平。2.实用性：兼顾不同层级实验室的硬件条件和人员技术水平，在保证检测准确度的前提下，尽量选择操作简便、成本可控的方法，确保标准的可推广性。3.协调性：与现行有效的法律法规、强制性国家标准和行业相关标准保持协调一致，避免技术指标上的矛盾和冲突。4.规范性：严格按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求，确保标准文本的编写质量。（二）主要编制依据本标准的编制主要依据以下技术文件和标准规范：-GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》-GB19489-2008《实验室生物安全通用要求》-GB/T14926.1《实验动物沙门菌检测方法》中微生物学检验通则-NY/T541-2016《兽医实验室质量和技术要求》-OIE《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（第29版，2021年）中关于副猪嗜血杆菌病的相关内容-CLSIVET01系列文件中关于动物源细菌抗菌药物敏感性试验的相关标准-国内外近十年发表的副猪嗜血杆菌分离鉴定相关研究文献四、标准主要技术内容NY/T4658-2025《动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程》规定了动物源副猪嗜血杆菌的分离培养、形态学观察、生化鉴定、分子生物学鉴定以及结果判定等技术要求。标准的主要技术内容包括以下几个方面：（一）样本采集、保存与运输样本采集是副猪嗜血杆菌成功分离的关键环节。标准明确规定：-采集对象：优先采集具有典型病变的濒死猪或新鲜死猪的浆膜渗出液、心包液、关节液、脑脊液及肺脏、肝脏、脾脏等实质器官。必要时可采集扁桃体拭子用于健康携带猪的调查。-采集时机：应在动物死亡后尽快采集，最好不超过4小时，以避免肠道菌群扩散污染和病原体衰亡。对于活体病猪，可采集鼻拭子或扁桃体拭子，但检出率相对较低。-采集工具与容器：使用无菌手术刀、剪刀、棉拭子等工具，装入无菌采样管或含转运培养基的采样管中。拭子采样后应立即放入Stuart转运培养基或Amies转运培养基中，保持湿润环境。-保存与运输：样本应在2-8℃条件下冷藏保存并在24小时内送达实验室。若运输时间超过24小时，应使用干冰进行冷冻运输，但需注意反复冻融会显著降低细菌存活率。-样本信息记录：样本应附有完整的送检单，内容包括动物来源、品种、日龄、免疫背景、临床症状、病理变化、采样日期、采样人等信息。（二）病原分离培养标准详细规定了副猪嗜血杆菌分离培养的全流程：-培养基选择：推荐使用含NAD（辅酶I）和血红素的巧克力琼脂平板或胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）+5%犊牛血清+NAD（终浓度10μg/mL）复合培养基。也可选用市售专用副猪嗜血杆菌选择性培养基。-接种方法：无菌挑取病料组织切面或渗出液，直接在培养基表面分区划线接种，以获得单个菌落。对于污染较严重的样品，可在培养基中添加适量抗生素（如杆菌肽、林可霉素等）抑制杂菌生长。-培养条件：置于37℃、5%-10%CO₂环境中需氧培养24-48小时。副猪嗜血杆菌为兼性厌氧菌，CO₂环境有助于其生长。培养24小时后观察有无可疑菌落；若无生长，应继续培养至48小时方可报告阴性。-菌落形态观察：副猪嗜血杆菌在巧克力琼脂或含NAD培养基上培养24小时后，形成直径约0.5-1.0mm、圆形、凸起、光滑、灰白色、半透明的小菌落。不产生溶血现象，有轻度黏稠度。-卫星生长试验：将待检菌涂布于不含NAD的马血琼脂平板上，交叉划线接种金黄色葡萄球菌，培养24小时后观察，若待检菌在金黄色葡萄球菌菌苔周围出现明显的"卫星生长"现象（即靠近金黄色葡萄球菌生长线的区域菌落较大、远离区域无生长或生长微弱），则提示该菌为NAD依赖性嗜血杆菌属成员。（三）形态学特征观察-革兰氏染色：副猪嗜血杆菌为革兰氏阴性细小杆菌，常呈多形性，可见球杆状、短杆状或长丝状形态，也有两极浓染现象。在新鲜培养物中形态较一致，在陈旧培养物中则呈现明显多形性。-染色特性：美蓝染色可见两极浓染现象，此特征有助于初步识别。（四）生化鉴定标准推荐使用商品化微量生化鉴定系统（如APINH、VITEKNH等）结合常规生化管进行生化特性鉴定。副猪嗜血杆菌的关键生化特征包括：-氧化酶阳性、触酶阳性（弱阳性或阴性）、脲酶阴性（与猪嗜血杆菌相区别）-糖发酵试验：葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖为产酸阳性；甘露醇、乳糖、麦芽糖、海藻糖为阴性-硝酸盐还原试验阳性-吲哚试验阴性-鸟氨酸脱羧酶阳性（与副禽嗜血杆菌相区别）-ALA卟啉试验阳性（表明该菌不需要外源性δ-氨基乙酰丙酸，可与猪嗜血杆菌属其他种鉴别）（五）分子生物学鉴定标准将PCR方法作为副猪嗜血杆菌鉴定的确认方法。标准推荐的PCR检测体系包括：-靶基因选择：以副猪嗜血杆菌16SrRNA基因为对象的种属特异性PCR。同时推荐使用基于荚膜多糖输出基因（*HPS*基因）或外膜蛋白P2基因的PCR方法作为辅助鉴定手段。-引物序列：标准附录中给出了推荐的引物序列、扩增片段大小、PCR反应体系和扩增程序等参数。其中16SrRNA基因PCR扩增产物大小约为821bp。-PCR产物分析：扩增产物经1.0%-1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在预期位置出现特异性条带判定为阳性。-测序确认：必要时对PCR产物进行序列测定，将测序结果与GenBank中副猪嗜血杆菌参考序列进行BLAST比对，同源性≥98%可确认为副猪嗜血杆菌。（六）血清型鉴定标准规定，在有条件的实验室，可进一步采用血清分型方法进行菌株的血清型鉴定。推荐的血清分型方法包括：-琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）或免疫酶斑点试验，使用特异性血清对1-15型进行分型-多重PCR血清分型方法，针对不同血清型特异性基因区域进行扩增分型（七）抗菌药物敏感性试验标准规定了副猪嗜血杆菌分离株的抗菌药物敏感性试验方法，推荐采用纸片扩散法（Kirby-Bauer法）或肉汤微量稀释法，按CLSI标准判定结果。建议检测的抗菌药物包括：氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、泰妙菌素、恩诺沙星、多西环素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶等兽医临床常用药物。（八）结果判定标准建立了系统的结果判定标准：1.分离阳性判定：培养获得典型菌落，且卫星生长试验阳性、革兰氏染色阴性、16SrRNAPCR特异性扩增阳性，可判定为副猪嗜血杆菌分离阳性。2.生化鉴定确认：符合副猪嗜血杆菌典型生化图谱（氧化酶阳性、脲酶阴性、鸟氨酸脱羧酶阳性等），可进一步确认。3.综合报告：结合流行病学信息、临床病变特征与实验室检测结果，出具综合性检测报告。（九）生物安全与质量控制标准从生物安全角度，要求涉及副猪嗜血杆菌的分离培养和鉴定操作应在不低于生物安全二级（BSL-2）实验室中进行，操作人员应经过专业培训并做好个人防护，实验废弃物应按医疗废物相关规定无害化处理。同时，标准对培养基批次质量控制、阳性对照菌株（如副猪嗜血杆菌参考株）的使用、阴性对照设置、检测记录与报告格式等提出了明确要求，以确保检测结果的可追溯性和可重复性。五、标准编制单位（一）主要起草单位概况NY/T4658-2025主要由中国动物卫生与流行病学中心牵头起草制定。中国动物卫生与流行病学中心（ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，CAHEC）是农业农村部直属的正司局级事业单位，是国家动物疫病预防控制技术支撑体系的核心机构。单位简介：中国动物卫生与流行病学中心前身为成立于1979年的农业部动物检疫所，2006年经中央机构编制委员会批准更为现名。中心总部位于山东省青岛市，设有国家外来动物疫病诊断中心、国家动物流行病学研究中心、国家动物卫生信息中心等国家级技术平台，并在全国设立了多个区域性分中心和监测站。中心现有专业技术人员近400人，其中高级职称人员占比超过40%，拥有博士、硕士学位人员超过60%，形成了一支结构合理、素质优良的