CN119390844A Cd3的特异性结合蛋白、双特异性抗体及其制备方法和应用 （华润生物医药有限公司）

道新澜社区观光路1301-84号银星智CD3的特异性结合蛋白、双特异性抗体及其本申请属于生物医药领域，具体涉及一种CD3的特异性结合蛋白、双特异性抗体及其制备方法和应用。本申请提供了一种双特异性抗体，其中包含特异性结合CD3的第一抗原结合域和特第一抗原结合域中的CD3抗体单链可变片段表面的抗原结合，这种结合方式可以显著激活T高肿瘤细胞杀伤活性的同时还具有较低的细胞因子释放水平，从而能够平衡T细胞双特异性抗2特异性结合CD3的第一抗原结合域和特异性结合AMHR2或GPC3的所述特异性结合CD3的第一抗原结合域包括权利要求1~3任一项所述的CD3的特异性结6.根据权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于NO.33所示的重链可变区和SEQIDNO.34所示的轻链可9.一种核酸分子，其特征在于，含有用于编码如权利12.一种权利要求11所述的细胞的制备方法，所述制备方法包括将所述核酸分子或者315.一种CD3检测产品，其特征在于，所述检测产品包括权利要求1~3中任一项所述的CD3的特异性结合蛋白和权利要求4~8中任一一项所述的CD3的特异性结合蛋白或权利要求4~8中任一项所述的双特异性抗体为检测抗胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。4[0002]CD3是一种存在于T细胞表面的蛋白质复合物，其主要功能是转导TCR识别抗原所构域很短而胞内结构域很长的ζ_ζ同源胞质，但由于TCRα和β链缺乏已知的细胞内信号基序，激活信号向第因子的转导由CD3蛋白复合体完成。γ链、δ链、ε链和ζ链含有的免疫受体酪氨酸激活基序衔接子和信号分子的募集以及LAT信号体的形成。这些途径的下游信号事件包括T细胞活[0005]目前尽管T细胞双特异性抗体在血液肿瘤中取得了一定的进展，但是其在实体肿[0007]因此，在临床治疗中的有效性和安全性是T细胞双特异性抗体开发成功的关键因5[0009]本申请一方面提供一种CD3的特异性结合蛋白；所述CD3的特异性结合蛋白具有[0020]本申请另一方面提供一种核酸分子，含有用于编码所述的CD3的特异性结合蛋白[0024]本申请另一方面提供所述的CD3的特异性结合蛋白的制备方法，所述制备方法包的特异性结合蛋白或双特异性抗体为检测抗体，通过免疫结合反应确定待测样品含CD3的6[0032]图1为本申请的双特异性抗体对CD3[0033]图2为本申请的双特异性抗[0036]图5为本申请的双特异性抗体在特异性杀伤卵巢癌细胞COV434_AMHR2的检测结[0038]图7为本申请的双特异性抗体杀伤卵巢癌细胞COV434_AMHR2的过程中T细胞介导[0039]图8为本申请的双特异性抗体特异性杀伤GPC3阳性的肝癌细胞Huh7的过程中T细78白分子，只要所述抗体表现出所需的生物活性即可。抗体可具有以下五种主要类别的免疫的免疫球蛋白具有不同且众所周知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸的或与其他分子体的抗原识别位点（例如，足以特异性地结合抗原的CDR区（complementarity_deter分钟原结合结构域结合至表位，并且结合需要在抗原结合结构域与表位之间具有一定的互补约氨基末端110至120个氨基酸或110至125个氨基酸和成熟轻链中的约90至115个氨基酸﹐其在抗体之间的序列方面不同并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在称为CDR的那些区域中，而可变结构域中保守性更高的区域被称为FR区9编号方案中称为35A和35BCDR1）、氨基酸位置50至65（CDR2）和氨基酸位置95至102Kabat编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。特异性地结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基衍射技术进行研究﹐并且可使用计算机软件如X_PLOR（YaleUniversity，1992，由MolecularSimulations，Inc.分售；参见例如，MethEnzymo1（1985）第114和115卷，WyckoffHW等人编辑；U.S.2004/0014194）和BUSTER（BricogneG（1993）ActaCrystallogrDBiolCrystallogr49（Pt137_60；BricogneG（1997）MethEnzymol276A：361_423，CarterCW编辑；RoversiP等人2000）ActaCrystallogrDBiol人1995）JBiolChem270：1388_1394以及CunninghamBC和WellsJA（1989）Science端的以27个氨基酸为主的多肽表位。其中很大一部分的CD3端抗体是以SP34为母本进行活性优化或人源化的序列改造，其他的例如Mosunetuzumab、Cevostamab、Elranatamab、[0081]所述CD3的特异性结合蛋白具有CD3结合结构域；所述CD3结合结构域具有SEQID氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)MolecularBiologyof端的以27个氨基酸为主的多肽表位。其中很大一部分的CD3端抗体是以SP34为母本进行活性优化或人源化的序列改造，其他的例如Mosunetuzumab、Cevostamab、Elranatamab、[0098]在一个具体的示例中，第二抗原结合域的重链CDR1如SEQIDNO.17所示、重链CDR2如SEQIDNO.18所示以及重链CDR3如SEQID[0099]在一个具体的示例中，第二抗原结合域的轻链CDR1如SEQIDNO.20所示、轻链CDR2如SEQIDNO.21所示以及轻链CDR3如SEQID[0100]在一个具体的示例中，第二抗原结合域的重链CDR1如SEQIDNO.23所示、重链CDR2如SEQIDNO.24所示以及重链CDR3如SEQID[0101]在一个具体的示例中，第二抗原结合域的轻链CDR1如SEQIDNO.26所示、轻链CDR2如SEQIDNO.27所示以及轻链CDR3如SEQIDDILMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSIN[0107]DILMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFGAGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQID[0109]QVQLQQSGTELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSSNYNEKFKGKA[0111]QVQLQQSGTELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSSNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVFYCARNCYGCSFDFDYWGQGTTLTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK[0113]QVQLVQSGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTDYNPSLKSRVT[0115]QVQLVQSGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARHAYREKGQFVPYYFYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT[0117]DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPNLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSG[0119]DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPNLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTIISLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREA[0121]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGAIEPETGGTAYNREFKDRV[0123]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGAIEPETGGTAYNREFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRYYSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYP[0125]DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSGQSLVHSNRNTYLQWYLLKPGQSPQLLIFKVSNRFSGVPDRFS[0127]DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSGQSLVHSNRNTYLQWYLLKPGQSPQLLIFKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,同上；Davis等人，1986,Basic[0142]本申请另一方面提供一种待测样本中的CD3的检测方法，所述检测方法以所述的CD3的特异性结合蛋白为检测抗体通过免疫结合反应确定待测之间的特异性结合反应。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数[0149]本申请另一方面提供所述的抗体或者所述的重组蛋白在制备治疗肿瘤的药物中床结果，诸如减少各种本申请靶抗原相关病症的发病率或改善所述病症的一个或多个症式可以显著激活T细胞功能。能够在保持较高肿瘤细胞杀伤活性的同时还具有较低的细胞过添加一个半胱氨酸与广泛使用的载体蛋白钥孔虫戚血蓝蛋白（KLH）或牛血清白蛋白疫反应。液进行冲击免疫。收集的小鼠脾脏细胞通过单B细胞筛选技术平台获得抗体轻链和重链可[0168]取Jurkat_NFAT_LucEffectorCells细胞，并以2×106细胞/mL重悬于细胞染色[0173]将上述筛选得到的CD3抗体阳性克隆（M132克隆）与人源化抗缪勒激素2型受体[0182]QVQLVQSGAEVKKPGASVTVSCKASGYTFTDYEMHWIRQPPGEGLEWIGAIDGPTPDTAYSEKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFRGGPKVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQESLSLSP（SEQID[0184]DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQPLVHSNRNTYLHWYQQKPGQAPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[0186]QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMHWVRQAPGKGLEWVAQIKDKSQNYATYVAESVKGRFTISRADSKNSIYLQMNSLKTEDTAVYYCRYVHYAAGYGVDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCP