高中生物 重点强化练97　PCR技术及应用

重点强化练97PCR技术及应用(分值∶55分)(第1～5题，每题5分，共25分。)一、选择题1．(2025·揭阳一中月考)利用PCR获得目的基因后，用限制酶EcoRⅠ同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如图所示。下列有关引物的分析正确的是()A．通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3B．检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1和引物4进行PCRC．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高PCR复性的温度D．DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的5′连接脱氧核苷酸答案A解析引物结合在模板链的3′端，通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3，A正确；引物结合在模板链的3′端，检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物2和引物4进行PCR，B错误；若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低PCR复性的温度，以便引物与模板链结合，C错误；DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的3′端连接脱氧核苷酸，D错误。2．如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是()A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物答案D解析根据DNA分子中两条链的反向平行关系及图示可判断，②链从L到R的方向为5′→3′，A错误；PCR过程是通过高温将双链DNA之间的氢键断开，并且是全部解旋之后才进行复制，B错误；以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23＝8，需消耗7个引物③，C错误。3．(2025·阜阳一中月考)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如图所示。下列叙述正确的是()A．应选择引物2和引物3进行PCR扩增B．设计的引物中G、C碱基含量越高，变性的温度越高C．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温DNA聚合酶及逆转录酶答案C解析DNA子链合成的方向为5′端到3′端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A错误；复性过程中引物与模板链结合，G、C碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，复性的温度越高，B错误；DNA分子被限制酶切割，然后环化并加入根据已知序列合成的引物，再通过PCR扩增得到中间是未知序列两侧是已知序列的DNA分子，所以PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，C正确；整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温DNA聚合酶，不需要逆转录酶，D错误。4．(2026·湖北部分名校联考)某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻蔬菜新品种。设计含有非特异性碱基配对的引物，将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中，获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是()A．过程②还需要四种核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶B．过程③至少需要两次循环才能得到两条链等长的DNA分子C．过程④需要使用引物1和4才能获得目的基因D．合成的DNA分子经混合、变性、杂交后发现通过引物2和3延伸形成的两条链杂交在一起，说明引物2和3的碱基序列相同答案B解析过程②是PCR扩增过程，PCR需要四种脱氧核糖核苷酸(不是核糖核苷酸)和耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)，A错误；过程③是PCR扩增含有突变位点的DNA片段，由于引物与模板链的结合位置不同，至少需要两次循环才能得到两条链等长的DNA分子，B正确；过程④经混合、变性后，杂交的两条单链均可为DNA聚合酶提供3′端，无需引物即可获得目的基因，C错误；合成的DNA分子经混合、变性、杂交后，通过引物2和3延伸形成的两条链杂交在一起，说明引物2和3的碱基序列互补，而不是相同，D错误。5．(2026·镇江联考)融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，再通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。如图所示为利用融合PCR技术构建CMP—GFP融合基因的基本过程(CMP为黄瓜花叶病毒运动蛋白基因，表达产物参与病毒在细胞间的转移；GFP为绿色荧光蛋白基因)。下列叙述错误的是()A．除图中所示外，融合PCR还需dNTP以及含Mg2＋的缓冲液等B．引物4需添加限制酶识别序列，引物2需添加与引物3部分互补的序列C．重叠延伸时，两条链分别为a、d或b、c，两者互作模板和引物D．CMP—GFP融合基因在受体细胞中表达可追踪病毒在细胞间的转移途径答案C解析融合PCR还需dNTP以及含Mg2＋的缓冲液等，dNTP可提供原料和能量，Mg2＋可激活DNA聚合酶，A正确；引物1和引物4需添加限制酶识别序列，引物2需添加与引物3部分互补的序列，从而为融合基因的形成提供引物，B正确；PCR扩增时，子链的延伸方向是5′→3′，a、d两条链中间碱基互补配对，两者可互作模板和引物，实现融合基因的扩增，C错误；CMP—GFP融合基因中含有绿色荧光蛋白基因，其在受体细胞中表达可追踪病毒在细胞间的转移途径，D正确。二、非选择题6．(16分)(2025·六安模拟)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示。回答下列问题：(1)无缝连接时，过程①中使用T5核酸外切酶目的是________________________________。过程③所需的酶有______________。(2)PCR技术分别扩增PABD和GFP基因时，配制的两个反应体系中不同的有________________。引物R1的设计需依据__________________________________________的核苷酸序列。据图分析引物F1和R2分别为________________(填序号)。A．5′－TCCGGACTCAGATAGC－3′B．5′－AGGCCTGAGTCTATCGTTATGTCCGGACTCAGATAGC－3′C．5′－GCTATCTGACTCCGGACTTGTACAGCTCGTCGTCTCA－3′D．5′－TCCGGACTCAGATAGCTATCGATGCGCAGCTGACGA－3′(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是______________。(4)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有________的MS培养基上进行筛选。T1代阳性植株自交，按单株收种并播种后获得的T2代中抗性幼苗占比为3/4，说明T1可能为单个位点插入的转基因株系。通过观测转基因拟南芥根尖细胞中____________，了解PA的动态变化。答案(1)沿5′→3′的方向水解DNA形成黏性末端DNA聚合酶和DNA连接酶(2)模板和引物PABD基因的一端和载体的一端AC(3)限制性内切核酸酶(4)草胺膦绿色荧光点的分布解析(1)过程①使用T5核酸外切酶的目的是沿5′→3′的方向水解DNA形成黏性末端。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到子链3′－OH末端)和DNA连接酶(将两个DNA片段进行连接)。(2)PCR扩增需要模板、原料、引物和TaqDNA聚合酶，扩增PABD和GFP这两种不同的基因，分别需要两种基因的单链DNA作为模板，即所需的模板不同，引物是根据目的基因复制起始端序列人工合成的，不同种类的基因所需的引物不同，综上分析，配制的两个反应体系中不同的有模板和引物。用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因(目的基因)需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应A；引物R2的一部分序列能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，引物R2对应C。(3)传统的酶切再连法需要用特定的限制性内切核酸酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，而无缝克隆技术构建重组质粒不需要限制性内切核酸酶。(4)bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T－DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。由题干信息“将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。7．(14分)(2025·广东菀佛深部分学校联考)人体内的t－PA蛋白能降解由血纤维蛋白凝聚而形成的血栓。若给心梗患者注射t－PA蛋白，因与血纤维蛋白结合的特异性低，会诱发颅内出血。将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的t－PA改良蛋白，显著降低出血的副作用。改良过程如图，回答下列问题：(1)重叠延伸时，提供引物的作用是____________________，以获取t－PA改良基因。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因______________________________。(2)据图，质粒pCLY11用限制酶________切开，改变启动子序列，可以影响重组质粒的________效率。与X射线诱变相比，该突变技术的优点是______________________________。(3)mlacZ表达产物会分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有__________________________的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌应具有的表型是______________________________。答案(1)使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸复性温度过低、引物特异性不高(2)XmaⅠ、BglⅡ转录目的性强，突变概率高(3)新霉素和X-gal长出的大肠杆菌菌落为白色解析(1)DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸；出现非目的序列产物的原因有：引物设计太短(或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性)、两引物之间碱基互补配对(形成引物二聚体)、复性温度过低、Mg2＋浓度过高、DNA模板出现污染等。(2)根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t－PA改良基因高效连接。改变启动子序列，可以影响重组质粒的转录效率。与X射线诱变相比，该突变技术目的性强，突变概率高。(3)在构建重组质粒时，其中的新