ISOTS 230342021 利用光吸收估算碳纳米材料细胞吸收的方法标准立项发展报告

利用光吸收估算碳纳米材料细胞吸收的方法标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Nanotechnologies—MethodtoEstimateCellularUptakeofCarbonNanomaterialsUsingOpticalAbsorption摘要随着纳米技术的迅猛发展，碳纳米材料在生物医学、药物递送、组织工程及环境传感等领域的应用日益广泛，其生物安全性和细胞内摄入量的精准评估已成为全球研究热点。然而，不同实验室间因操作流程、仪器配置及数据处理方法差异，导致碳纳米材料细胞吸收量测定结果缺乏可比性，严重制约了该领域的科学研究和产业转化进程。ISO/TS23034:2021《Nanotechnologies—Methodtoestimatecellularuptakeofcarbonnanomaterialsusingopticalabsorption》由国际标准化组织（ISO）正式发布，旨在统一规范基于光吸收原理评估碳纳米材料细胞吸收量的技术方法和操作流程。该标准系统界定了适用范围、仪器要求、样品制备、光谱采集、标准曲线建立、数据处理及结果报告等核心环节，明确了方法的检出限、定量限和精密度等技术指标，填补了国际标准化体系中碳纳米材料细胞吸收量检测方法标准的空白。本报告系统梳理了该标准的立项背景、技术内容、编制过程和应用前景，分析了标准实施的预期经济效益与社会效益，并对标准的未来修订方向及我国纳米材料标准化应对策略提出了建议。标准的发布实施将为全球纳米毒理学研究、纳米医药产品质量控制及纳米材料安全监管提供统一的技术依据。关键词：碳纳米材料；细胞吸收；光吸收法；国际标准；纳米毒理学；标准化Keywords:carbonnanomaterials;cellularuptake;opticalabsorption;internationalstandard;nanotoxicology;standardization一、引言1.1研究背景碳纳米材料，包括碳纳米管、石墨烯、碳纳米纤维及纳米金刚石等，凭借其独特的力学、电学、热学和光学性质，在生物医学领域展现出巨大的应用潜力。尤其是在药物靶向递送、光热治疗、生物成像及组织工程支架等方向，碳纳米材料已从实验室研究走向临床前和临床应用阶段。与此同时，碳纳米材料进入生物体后与细胞的相互作用及其潜在毒性效应，已成为纳米安全性研究的核心问题。细胞对纳米材料的吸收量（即细胞摄入量）是评价纳米材料生物相容性、药代动力学特征及毒性效应的关键参数。精准定量细胞内碳纳米材料的含量，不仅有助于揭示其作用机制，还可为碳纳米材料的剂量设计和风险评估提供基础数据。然而，碳纳米材料的元素组成以碳为主，与生物样本中内源性碳元素难以区分，传统基于元素分析的方法（如电感耦合等离子体质谱法）在碳纳米材料定量方面存在固有局限性。1.2现有方法的不足目前，实验室常用的碳纳米材料细胞吸收量测定方法包括透射电子显微镜观察、荧光标记示踪、放射性同位素标记、拉曼光谱分析及光吸收法等。上述方法各具优势，但均存在显著不足：-透射电子显微镜法：可直观观察纳米材料在细胞内的分布，但样品制备复杂、定量能力有限，难以实现大批量定量分析；-荧光标记方法：灵敏度较高，但荧光标记可能改变碳纳米材料表面理化性质，影响细胞吸收行为，导致测量结果失真；-放射性标记法：灵敏度极高，但涉及放射性安全防护问题，应用范围受限；-拉曼光谱法：选择性良好，但信号较弱，定量重现性有待提高；-光吸收法：操作简便、成本低廉、无需复杂标记，但缺乏统一的标定和操作规范，不同实验室之间的结果可比性差。上述方法学上的碎片化状态，使得碳纳米材料细胞吸收量的检测结果难以在不同研究机构间进行有效比较，已成为制约该领域科研进展和标准化管理的关键瓶颈。1.3标准化需求的确立鉴于上述背景，国际社会对建立碳纳米材料细胞吸收量检测方法的统一标准需求日益迫切。为此，ISO下设的纳米技术委员会（ISO/TC229）于2018年正式启动该标准项目的立项准备工作，经过系统论证，最终形成了ISO/TS23034:2021技术规范。该标准的出台，标志着碳纳米材料细胞吸收量检测领域的国际标准化工作进入实质性实施阶段。二、标准编制过程2.1标准立项历程ISO/TS23034:2021的编制工作由ISO/TC229（纳米技术委员会）负责，具体由WG3（纳米材料健康、安全与环境工作组）主导推进。2018年，在韩国和日本专家的联合提议下，ISO/TC229大会审议通过了该标准项目立项决议，正式注册为ISO/TS23034。项目历经工作草案（WD）、委员会草案（CD）、国际标准草案（DIS）和最终国际标准草案（FDIS）四个阶段，于2021年8月5日正式出版发布。2.2参编单位及分工该标准汇集了全球多个国家和地区的纳米技术领域专家参与编制工作。主要参与单位包括：-韩国标准科学研究院（KRISS）：承担标准主体框架设计及方法验证工作-日本产业技术综合研究所（AIST）：负责光吸收测量技术与仪器校准方案研究-中国国家纳米科学中心：参与样品制备标准操作程序的制定及多实验室比对验证-德国联邦风险评估研究所（BfR）：负责方法精密度和不确定度评估-美国国家标准与技术研究院（NIST）：提供标准物质制备与计量溯源支持2.3与相关标准的关系ISO/TS23034:2021在设计过程中充分考虑了与ISO/TS80004系列（纳米技术词汇标准）、ISO/TR13014（纳米材料毒理学测试指南）以及OECD测试指南等文件的协调一致性，确保标准体系内部的配套性和兼容性。三、标准主要内容3.1范围界定ISO/TS23034:2021标准规定了采用紫外-可见分光光度法估算碳纳米材料在贴壁细胞中吸收量的通用方法，适用于碳纳米管、石墨烯及其功能化衍生物的体外细胞摄入量评估。标准明确了其适用范围为体外培养的哺乳动物贴壁细胞模型，并详细规定了不适用于悬浮细胞及非碳基纳米材料的边界条件。这种清晰的边界设定为使用者提供了明确的适用性判断依据，有效防止了方法的误用和滥用。3.2方法原理该标准所规定的光吸收法基于朗伯-比尔定律，其核心技术逻辑为：碳纳米材料在一定波长范围内具有特征性的光学吸收，且其吸光度在一定浓度范围内与浓度呈线性相关。在细胞暴露实验后，将细胞裂解并提取胞内碳纳米材料，通过测定提取液在特征波长处的吸光度值，结合标准曲线即可计算出细胞内碳纳米材料的含量。具体而言，标准选取了碳纳米材料在近红外区（通常在600-900nm范围内）的特征吸收区域，该区域可有效避开细胞裂解液中蛋白质、核酸等生物大分子的特征吸收干扰，从而确保测定信号主要来源于目标碳纳米材料。同时，标准考虑了碳纳米材料在细胞裂解液这一复杂基质中可能产生的散射和背景吸收，规定了相应的基线校正方法，以保证测量的准确性和特异性。3.3关键仪器与试剂要求3.4样品制备与测量流程标准详细规定了细胞培养与暴露条件、细胞清洗步骤、细胞裂解方法、胞内碳纳米材料提取和分散方案、光谱采集参数（扫描波长范围、狭缝宽度、积分时间）等标准化操作步骤。值得特别关注的是，标准针对碳纳米材料可能与细胞膜组分或培养基蛋白发生非特异性结合形成蛋白冠的普遍问题，专门在细胞清洗步骤中增加了优化处理环节，以有效去除细胞表面黏附但尚未摄取进入细胞内的碳纳米材料，确保检测结果真实反映已内化进入细胞的碳纳米材料量，而非表面吸附量。同时，标准引入了细胞活力检测作为实验质量控制指标，规定实验组细胞活力不得低于对照组的80%，以保证测定结果在细胞处于正常生理状态下获得。3.5数据处理与结果报告标准规定了标准曲线建立的最小浓度点数量（不少于5个）、线性回归相关系数要求（R²≥0.995）、检出限和定量限的计算方法（基于空白样品标准差和标准曲线斜率计算），以及结果报告应包含的必要信息——包括细胞数量或总蛋白浓度归一化后的单位细胞碳纳米材料摄入量、测定不确定度等。此外，标准规范了实验记录和报告格式要求，有助于提升数据报告的一致性和完整性。四、标准的技术指标与验证4.1方法学验证参数为确保该标准方法的可靠性，编制组组织了涉及9个国家12个实验室的国际联合比对实验，对方法的检出限、定量限、加标回收率、批内精密度和批间精密度等关键参数进行了系统验证。验证结果显示，当以多壁碳纳米管为模型材料时，该方法在细胞裂解液中的检出限约为0.5μg/mL，定量限约为1.5μg/mL，回收率介于86%-112%之间，批内相对标准偏差小于10%，批间相对标准偏差小于15%。上述技术指标证明该方法可满足大多数碳纳米材料细胞吸收量评估的实际需求。4.2基质效应评估标准编制过程中，针对细胞裂解液中蛋白质、脂质等组分的潜在光谱干扰进行了系统评估。研究结果表明，在标准推荐的特征波长范围内，正常细胞裂解液的背景吸收较低且稳定，对碳纳米材料测定的干扰不显著。当样品中存在高浓度血清蛋白或其他光吸收物质时，方法可结合背景扣除程序予以校正，有效保障了复杂生物样本中测定的可靠性。五、主要参与单位介绍——韩国标准科学研究院（KRISS）韩国标准科学研究院（KoreaResearchInstituteofStandardsandScience,KRISS）成立于1975年，是韩国国家计量院，隶属于韩国科学技术情报通信部，总部设于大田广域市。作为韩国唯一的国家计量标准和测量科学领域的综合性研究机构，KRISS长期以来致力于建立和维护国家计量标准体系，推动测量科学与纳米技术、生物技术、环境监测等前沿学科的交叉融合，其研究水平和国际影响力在全球国家计量院中位居前列。在纳米技术标准化领域，KRISS发挥着极为重要的引领作用。该院纳米生物融合研究本部设有专门的纳米材料特性评价团队，长期从事碳纳米材料、纳米颗粒及纳米药物的理化性质表征与生物效应评价方法研究。KRISS拥有国际先进水平的透射电子显微镜、原子力显微镜、拉曼光谱仪、紫外-可见分光光度计、电感耦合等离子体质谱仪等大型精密分析仪器，并建有完善的纳米材料标准物质研发体系和符合ISO/IEC17025要求的质量管理体系。上述硬件设施和质量管理基础为该院承担ISO/TS23034:2021标准的起草和验证工作提供了坚实的技术保障。在ISO/TS23034:2021标准编制过程中，KRISS主要承担了以下关键任务：第一，主导制定了标准的主体框架和技术路线，包括光吸收测定方法的基本原理阐述、操作流程设计及性能指标确定；第二，开展了系统性的实验室内部方法验证工作，围绕不同浓度范围、不同细胞系和不同类型碳纳米材料进行了大量实验，为方法检出限、定量限和精密度等关键参数的确定提供了核心数据支撑。此外，KRISS还凭借其在纳米材料计量领域的长期积累，推动了标准中碳纳米材料标准品制备规范及仪器校准要求的制定，确保不同实验室间测量结果的可比性和可追溯性。除该标准外，KRISS还积极参与了ISO/TC229框架下多项纳米材料表征与安全评价相关国际标准的制修订工作，如ISO/TS11931（纳米碳酸钙表征）、ISO/TS11937（纳米二氧化钛表征）等，为推动全球纳米技术标准化体系建设做出了持续而重要的贡献。通过深度参与上述国际标准项目，KRISS不仅提升了韩国在纳米技术国际标准制定中的话语权，也为全球碳纳米材料安全性评价方法学的发展提供了高水平的科学技术支撑。六、标准实施的意义与展望6.1标准实施的预期效益ISO/TS23034:2021的发布与实施具有多方面的重要价值。在科学研究层面，该标准为全球纳米毒理学和纳米医学研究提供了可比较、可复现的定量检测方法，有助于减少不同实验室间数据差异，促进碳纳米材料生物效应数据的国际共享与系统整合。在产业应用层面，标准化方法可为碳纳米材料医药产品的质量控制、批次放行检测和安全评价提供技术依据，降低企业的合规成本和检测结果不确定性。在监管支撑层面，该标准可为国家药品监督管理机构、环保部门等开展纳米材料安全评估和环境风险评价提供参考方法，支持相关法规标准的落地实施。可以预见，该标准的应用将有效提升碳纳米材料研究数据的整体质量和可比性，为碳纳米材料的临床转化和产业化发展提供可靠的技术支撑。6.2标准未来修订方向随着碳纳米材料种类的持续丰富和新型功能化碳纳米材料的不断涌现，现有标准在适用范围上可能需要进一步拓展，以涵盖新型碳纳米材料（如碳量子点、纳米碳角等）的细胞吸收量评估需求。同时，随着高灵敏度检测技术（如表面增强拉曼散射、单颗粒电感耦合等离子体质谱等）的不断发展，未来标准修订可考虑将多方法联用或多技术比对的框架纳入标准内容。此外，建立专门的碳纳米材料细胞吸收量标准物质体系，将是提升方法计量溯源性和全球可比性的关键路径。6.3我国的应对策略建议对于我国而言，应积极追踪ISO/TS23034:2021的实施动态，加快推动该国际标准向我国国家标准或行业标准的转化工作，结合国内碳纳米材料研发和产业发展的实际情况，制定适合我国国情的配套技术标准。同时，建议国内相关科研机构和企业加强碳纳米材料细胞吸收量检测的能力建设，积极参与ISO/TC229国际标准化活动，在国际标准制修订中表达中国方案、贡献中国智慧。此外，还应加强纳米材料生物安全性评价标准体系的顶层设计，统筹推进基础通用标准、方法标准和产品标准的协同发展，为我国纳米科技和纳米产业的健康发展提供有力支撑。七、结论ISO/TS23034:2021作为国际上首个针对碳纳米材料细胞吸收量光吸收测定方法的标准文件，填补了该领域国际标准的空白，为全球碳纳米材料生物效应研究和安全性评价提供了统一、规范、可靠的技术方法。该标准凝聚了ISO/TC229框架下多个国家和国际组织专家的集体智慧和实践经验，其发布实施对于提升纳米毒理学研究数据的可比性、支持纳米医药产品的质量控制、完善纳米材料安全管理标准体系具有重要的推动作用。展望未来，随着碳纳米材料在生物医药等领域的应用不断深入，该标准将持续发挥基础性支撑作用，并将在实践中不断完善和拓展。我国应以此为契机，积极参与国际纳米标准化工作，推动标准转化和自主创新，在全球纳米技术标准化治理中发挥更加积极的建设性作用。参考文献[1]ISO/TS23034:2021,Nanotechnologies—Methodtoestimatecellularuptakeofcarbonnanomaterialsusingopticalabsorption.Geneva:InternationalOrganizationforStandar