T-CNHAW 0021-2025 人体尿液中16种抗生素的测定 液相色谱－串联质谱法

ICS11.020CCSC10CNHAWDeterminationofsixteenantibioticsinhumanurine—LiquidchromatographytandemmassspectIT/CNHAW0021—2025前言 2规范性引用文件 4试剂和材料 5仪器设备 26样品采集、运输和保存 27分析步骤 28方法特性 49质量保证与质量控制 510注意事项 5附录A（资料性）16种抗生素的基本信息 6附录B（资料性）16种抗生素及内标的参考质谱参数和保留时间 8附录C（资料性）16种抗生素的提取离子流图 T/CNHAW0021—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件的附录A、附录B、附录C为资料性附录。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国民族卫生协会提出并归口。本文件起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、山东省公共卫生临床中心、山东省疾病预防控制中心、无锡市疾病预防控制中心、深圳市罗湖区疾病预防控制中心、茂名市中医院。本文件主要起草人：胡小键、张续、朱英、李振环、倪一平、付慧、王晓琳、吴林林、郑凤家、吴宇伉、朱波、纪翔、徐建华。本文件为首次发布。1T/CNHAW0021—2025人体尿液中16种抗生素的测定液相色谱－串联质谱法本文件规定了人体尿液中16种抗生素的液相色谱－串联质谱测定方法。本文件适用于尿液样品中16种抗生素（阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、四环素、强力霉素、土霉素、恩诺沙星、培氟沙星、洛美沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯哒嗪、林可霉素）的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T38735人类尿液样本采集与处理3原理尿液样品中的抗生素经β-葡萄糖醛酸酶水解，用亲水-亲脂共平衡聚合物固相萃取技术进行富集和净化，液相色谱－串联质谱正离子多反应监测模式测定，以目标物的保留时间和离子丰度比定性，同位素内标法定量。4试剂和材料4.1除非有特殊说明，所有试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.2乙酸（CH3COOH）。4.3乙腈（CH3CN）。4.4甲酸（HCOOH）。4.5乙酸铵（CH3COONH4）。4.6甲醇（CH3OH）。4.7β-葡萄糖醛酸酶：来源于罗曼蜗牛(Helixpomatia)，活性≥85000U/mL。4.8乙酸铵缓冲溶液（c=1.0mol/L，pH=5.5称取乙酸铵19.3g于500mL烧杯中，加入约200mL水，混匀，加入乙酸，调节pH至5.5，倒入250mL容量瓶，用水定容。4.9标准物质：恩诺沙星、培氟沙星、洛美沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺氯哒嗪、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、四环素、磺胺喹噁啉和林可霉素纯度为96%以上，强力霉素纯度为92%以上，土霉素纯度为93%以上；标准物质的基本信息见附录A。4.10同位素内标：D3-阿奇霉素、13C-D3-克拉霉素、D7-罗红霉素、D3-强力霉素、D5-恩诺沙星、D3-培氟沙星、D5-洛美沙星、D4-磺胺二甲嘧啶、13C6-磺胺甲噁唑、D4-磺胺嘧啶、13C3-甲氧苄啶、D4-磺胺喹噁啉、D4-磺胺氯哒嗪、D3-林可霉素纯度为95%以上，D6-四环素纯度为80%以上。4.11标准储备溶液：分别准确称取标准物质和内标10mg（精确至0.1mg）于10mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，配成1.00g/L的单标标准储备溶液，-20℃以下保存6个月；也可直接使用符合要求的有证标准溶液。4.12混合标准中间溶液：分别准确移取各目标物标准储备溶液适量，用甲醇配制成10.0mg/L的混合标准中间溶液，-20℃以下可保存3个月。2T/CNHAW0021—20254.13混合标准使用溶液：取混合标准中间溶液0.100mL置于10mL容量瓶中，用20%（V/V）甲醇水溶液定容，配成100μg/L的混合标准使用溶液，现用现配。4.14同位素混合内标中间溶液：取适量内标标准储备溶液置于25mL容量瓶中，用甲醇配制成4mg/L的混合内标中间溶液，置于冰箱-20℃以下保存3个月。4.15同位素混合内标使用溶液：取同位素混合内标中间溶液1.00mL置于10mL容量瓶中，用20%（V/V）甲醇水溶液配制成400μg/L的同位素混合内标使用溶液，现用现配。4.1696孔固相萃取板（或萃取柱）：采用聚苯乙烯二乙烯基苯吡咯烷酮亲水亲酯平衡填料（30mg，2mL）或性能相当者。5仪器设备5.1液相色谱-三重四极杆质谱仪：配电喷雾离子源。5.2电子天平：感量为0.1mg和0.01g。5.3恒温水浴锅：可控制37℃±2℃。5.4离心机：最大转速4500r/min。5.596孔固相萃取板装置或固相萃取装置。5.6涡旋混匀器。5.7氮吹仪。6样品采集、运输和保存6.1样品采集按GB/T38735中规定的方法采集。样品最少采集2.5mL。采集的样品应装在硼硅酸盐玻璃或聚丙烯材质的采样管中，使用聚丙烯或聚四氟乙烯材质的盖子，不得使用橡胶塞。样品采集过程中增加现场空白样品的采集。现场空白样品需采用不含有待测目标物的纯水，使用与实际样品相同的采样管，在采样现场进行同步操作。。6.2样品运输和保存现场采集时，如无冷冻保存条件，可先将尿液样品在放置有冰袋或冰盒的保温箱中暂存，并在12h内-20℃冷链运输至实验室，避光保存。空白样品随同尿液样品保存和运输。尿液样品在-80℃下可至少保存2周。7分析步骤7.1样品前处理7.1.1样品准备将冻存的尿液样品取出，在4℃下解冻并自然放置至室温。7.1.2样品制备用涡旋混匀器混匀尿液样品，准确移取1.00mL于96孔收集板中（或5mL塑料离心管中），依次加入400μg/L的混合内标（4.15）10μL、β-葡萄糖醛酸酶（4.7）20μL、乙酸铵缓冲溶液（4.8）200μL，在涡旋混匀器上充分振荡，置于37℃水浴酶解16h，取出冷却至室温。离心10min（4500r/min取上清液进行固相萃取。7.1.3固相萃取依次用1mL甲醇和1mL水活化96孔固相萃取板（或萃取柱）。将7.1.2的上清液转移至96孔固相萃取板（或萃取柱）。在不加压力的条件下依靠自然重力过板（或柱）。样品过板（或柱）后，用1mL纯水快速淋洗，负压抽干5min，后用1mL甲醇缓慢洗脱固相萃取板（或萃取柱），重复一次，收集洗3T/CNHAW0021—2025脱液。洗脱完毕后，于洗脱液中加入纯水200μL，45℃氮吹至约200μL，以4500r/min速度离心10min，待进样，进样前4℃保存。7.2方法空白试验同步进行空白试验，其过程与样品分析的全过程一致，仅不加入样品。7.3仪器参考条件7.3.1液相色谱参考条件a）色谱柱：高强度硅胶基质反相C18柱，100mm（柱长）×3.0mm（内径1.8μm（粒径或等效色谱柱。b）流动相：A为0.1%（V/V）甲酸水溶液，B为0.1%（V/V）甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序见表c）流速：0.30mL/min。d）柱温：40℃。e）样品室温度10℃。f）进样量：5μL。表1液相梯度洗脱程序3355337.3.2质谱参考条件a）离子源：电喷雾离子源（ESI）。b）电离模式：正离子模式。c）扫描方式：多反应监测（MRM）。d）其他质谱参数参见附录B。7.4校准7.4.1标准系列工作溶液配制分别准确移取混合标准使用溶液0.05mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL于10mL容量瓶中，加入同位素混合内标使用溶液0.50mL，用20%（V/V）甲醇水溶液定容，混匀。标准系列工作溶液中各目标物质量浓度分别为0.50μg/L、2.50μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、25.0μg/L、50.0μg/L，同位素内标浓度为20.0μg/L，现用现配。7.4.2校准曲线绘制按仪器参考条件，依次测定标准系列溶液。以定量离子峰面积和内标峰面积比值为纵坐标，以待测目标物的质量浓度与内标质量浓度的比值为横坐标，绘制校准曲线（权重取1/x）。各目标物的提取离子流图见附录C。7.5样品测定7.5.1定性分析4T/CNHAW0021—2025在相同测试条件下，尿液样品中抗生素与其对应内标的保留时间之比与标准溶液中抗生素与其对应内标的保留时间之比偏差在1%以内；且检测到的相对离子丰度应与浓度相当的标准溶液相对离子丰度一致，其允许偏差为±40%。7.5.2定量分析尿液样品中待测目标物的浓度按公式（1）计算：式中：ρ—尿液样品中目标物的质量浓度，单位为微克/升(μg/L）；Ax—目标物的峰面积；Ais—目标物对应内标的峰面积；Cis—尿液样品进样时的内标浓度，单位为微克/升(μg/L）；a—校准曲线的斜率；b—校准曲线的截距；n—尿液样品前处理过程的浓缩倍数；P—标准物质的纯度校正因子。当标准物质纯度低于95%，应进行纯度校正。测量结果保留三位有效数字，但当结果接近方法检出限时，其小数点位数应与检出限保持一致。8方法特性8.1方法检出限和定量限16种抗生素的方法检出限为0.02μg/L~0.13μg/L，方法定量限为0.06μg/L~0.40μg/L，具体见表2。表216种抗生素的方法检出限和定量限目标物名称方法检出限/(μg/L）方法定量限/(μg/L）阿奇霉素0.020.06克拉霉素0.030.08罗红霉素0.020.07四环素0.020.06强力霉素0.020.06土霉素0.040.12恩诺沙星0.030.09培氟沙星0.060.20洛美沙星0.120.40磺胺二甲嘧啶0.130.40磺胺甲噁唑0.040.11磺胺嘧啶0.030.09甲氧苄啶0.100.30磺胺喹噁啉0.040.12磺胺氯哒嗪林可霉素0.030.030.100.108.2精密度和回收率16种抗生素的加标回收率为80%~120%，精密度为1.5%~16.2%。5T/CNHAW0021—20259质量保证与质量控制9.1实验室应定期考察灵敏度、校准曲线、精密度和回收率，以确保分析系统处于正常状态。9.2每批试验应至少包含1个质控样品，1个方法空白，并按5%的比例设置平行样（不足20个样品时至少设置1个平行样）。9.3可使用标准参考物质、质控样品和加标回收等方式评估方法准确性。标准参考物质的检测结果应符合给定的目标物参考值范围；质控样品测定结果应满足每次测定值落在相应目标物均值的±2倍标准偏差内，且连续测定10次的测定结果不能落在均值同侧；加标回收率应满足检验方法要求。9.4方法空白应低于方法检出限。若不能满足要求，需确定方法空白来源，评估方法空白的稳定性。稳定性评估中，需进行不低于6批次的方法空白试验，根据方法空白中目标物的质谱响应值，计算相对标准偏差，若低于20%，且无显著趋势性变化，表示方法空白稳定，可根据空白样品和实际尿液样品中目标物的含量水平评估扣除空白的可能性。9.5平行样测定结果的相对偏差应小于10%。9.6每批试验应重新配制校准曲线，不得采用单点校正等方法代替校准曲线。校准曲线应包括不少于5个平均分布的标准浓度点（不包含零点）。采用1/x权重拟合校准曲线，各目标物的相关系数＞0.995。用校准曲线反推各标准点浓度，定量限测量值应在校准点浓度的±30%以内，其余各浓度点应在±20%以内。10注意事项10.1乙酸铵溶液不宜一次性配制过多，建议根据实验需要现用现配。10.2尿液样品长期保存应置于-80℃,样品保存超过2周应注意抗生素的降解。10.3尿液样品经前处理过程所得到的样品溶液可能存在降解。如在完成样品前处理后不能立即测定，应将样品溶液保存于-20℃以下条件下，并在5d内完成测定。10.4尿液样品反复冻融3次，未发现抗生素明显降解，超过3次冻融需注意可能引起降解。10.5样品中抗生素浓度超过线性范围时，需进行复测。复测时，应采用减少取样体积或稀释待测尿液样品的方式，不得直接稀释经过前处理的样品溶液。10.6连续对两个样品进行测定时，当第一个样品浓度超过第二个样品50倍且第二个样品测定值高于定量限时，需对第二个样品进行复测。10.7样品中内标未检出时，需对该样品进行重复进样。当重复进样测定仍未检出内标时，可判