T-CVMA 230-2025 鸡红螨病诊断技术规范

CCSB41中国兽医协会发布IT/CVMA230—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由河南农业大学提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：河南农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、中国农业大学、新疆石河子大学、中农华威制药股份有限公司。本文件主要起草人：菅复春、张龙现、邵卫星、潘保良、孟庆玲、菅忆晨、李森阳、张素梅、王荣军、李俊强、李晓迎、许会艳、游锡火、曾徐浩、何钦义。T/CVMA230—20251鸡红螨病诊断技术规范本文件规定了鸡红螨病的PCR检测技术及其所导致的鸡红螨病的诊断技术要求。本文件适用于鸡红螨病的临床诊断及病原鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鸡红螨Poultryredmite即鸡皮刺螨，属节肢动物门、蛛形纲、蜱螨目、皮刺螨科、皮刺螨属的一种寄生于鸡、鸽等多种禽类体外的吸血寄生虫。3.2鸡红螨病Poultryredmitedisease由鸡皮刺螨寄生在鸡表皮上特别是泄殖腔周围，引起鸡皮肤红肿、损伤、炎症以及贫血、消瘦、生产性能下降为主要症状的体外寄生虫病。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BSL：生物安全防护实验室（Animalbiosafetylaboratory）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosideDriphosphate）ITS：内转录间隔区（InternalTranscribedSpacer）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsalinebuffer）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）2T/CVMA230—2025TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（TrisAcetate-EDTABuffer）5试剂、耗材和设备5.1试剂5.1.1除非另有说明，检测中所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求。5.1.2商业化PCR扩增试剂盒，包含DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物。5.1.3PBS缓冲液。5.1.4DL2000DNAMarker。5.1.51×TAE，见附录A。5.1.61.5%琼脂糖（电泳级），见附录A。5.1.7DNAGREEN核酸染料。5.1.8商品化DNA提取试剂盒。5.1.9鸡红螨阳性对照：使用经显微镜形态学检测确认为鸡红螨的虫体提取的基因组DNA。5.2耗材5.2.11.5mL、2mL无DNA酶和RNA酶灭菌离心管。5.2.250μLPCR管、200μLPCR管。5.2.3载玻片。5.2.4盖玻片。5.3耗材5.3.2光学显微镜。5.3.3PCR扩增仪。5.3.4微波炉。5.3.5核酸电泳系统。5.3.6凝胶成像仪。6生物安全要求6.1样品的采集3T/CVMA230—2025应按照GB/T27401的相关要求进行采样。具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员操作，操作时应带上手套、口罩、工作服，身上喷洒驱蚊胺或植物源驱避剂；使用大号毛笔将样品从鸡体或螨类聚集堆直接扫进自封袋中，防止鸡红螨逃逸扩散。6.2样品鉴定应按照GB19489的相关要求，在生物安全1级（BSL-1）实验室中进行检测工作，检测后的样品的处理应按照GB/T27401中有关规定进行处理。7临床诊断7.1临床症状7.1.1患病鸡只出现大量羽毛脱落、啄毛。感染严重时，病鸡瘙痒不安并开始燥动不安，容易惊群，夜间有鸡惊叫。7.1.2患病鸡皮肤有红疹和损伤，出现贫血、消瘦、精神不振、采食量及产蛋量下降等症状。7.2病理变化病理变化不明显，感染严重时在鸡被叮咬处的皮肤上可见红疹和皮肤损伤或结痂皲裂。7.3流行病学多发于笼养鸡，更容易在蛋鸡场传播暴发，每年7~9月的高温潮湿季节感染更严重，冬季气温降低后逐渐消失。8显微镜检查8.1光学显微镜玻片标本制备8.1.1取1张洁净载玻片，滴加5μL甘油，将鸡红螨放入甘油中盖上盖玻片。8.1.2再用昆虫针拨动鸡红螨，摆正姿势并清除螨体上的杂物，头朝前，腹面向上，各足伸展。8.2显微镜检查在光学显微镜下观察采集到的螨虫样品的躯体，进行形态学鉴定，观察足的对数以及是否有螯肢、须肢。8.3结果判定8.3.1鸡红螨形态鸡红螨形态具有以下特征（形态学图片见附录B）：a）鸡红螨虫体较小，非饱血状态下的虫体呈褐色或棕黑色或淡黄色，体长0.45mm~1.45mm；b）饱血的虫体偏红呈红黑色，吸饱血后可达1.5mm；c）在光学显微镜下根据比例尺测算虫体大小是否符合鸡红螨特征；d）在光学显微镜下，鸡红螨呈偏长椭圆形，前端有长的口器，后部宽于前躯，虫体体表布满短绒毛；4T/CVMA230—2025e）腹面有4对长足（幼虫3对），在虫体的前半部分；f）螯肢呈细针状，短而小，适宜叮刺吸血；g）在螯肢两侧各有一个须肢。8.3.2结果判断8.3.2.1在光学显微镜下，虫体体长符合鸡红螨大小，且能够观察到4对足（幼虫为3对）、有螯肢和须肢，可初步判定为疑似鸡红螨病。8.3.2.2在光学显微镜下，虫体体长不符合鸡红螨大小，且不能够观察到4对足（幼虫为3对）以及螯肢和须肢，可判断为鸡红螨阴性。9PCR检测9.1DNA制备将置于2mL的离心管中的鸡红螨虫体，利用商业化DNA提取试剂盒在室温（15℃~37℃)下提取虫体DNA，提取好的虫体DNA立即进行PCR扩增或者放置于-20℃保存备用。9.2PCR扩增9.2.1反应体系应按照附录C.1反应体系，用引物18SrRNA·ITS·28SrRNA-F/18SrRNA·ITS·28SrRNA-R和Cox1-F/Cox1-R（见附录C.2）组合分别配制PCR反应体系，反应体系为50µL。鸡红螨阳性对照模板为5.1.9所列鸡红螨DNA2µL，阴性对照为不加阳性DNA模板的水。反应程序见附录C.3。9.2.2电泳分析及成像取1.5g琼脂糖加入100mL1×TAE电泳缓冲液（见附录A.1）中，于微波炉中加热并充分溶化，制备琼脂糖凝胶液（见附录A.2），然后按照0.5μL/10ml的量在琼脂糖凝胶液中加入商业化的绿如蓝核酸染料，然后冷却制备凝胶。在电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；取20μLPCR扩增产物和相应量加样缓冲液混合后加样，进行电泳，电泳时间30min；然后凝胶成像分析系统观察结果并拍照。9.3结果判定9.3.1质控标准鸡红螨阳性对照出现519bp（18SrRNA/ITS/28SrRNA）或453bp（Cox1）的特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立；否则，结果不成立。9.3.2结果判定与DNA标准分子量比对，阳性对照以及检测样品同时出现大小为519bp（18SrRNA/ITS/28SrRNA）或453bp（Cox1）扩增片段，并且阴性对照无扩增条带时，判定为鸡红螨阳性（见附录D）。与DNA标准分子量比对，阳性对照出现大小为519bp（18S-28SrRNA）或453bp（Cox1）扩增片段，并且阴性对照以及检测样品无扩增条带时，判定为鸡红螨阴性。10综合判定5T/CVMA230—202510.1.1符合8.3.2中疑似鸡红螨形态特征且符合9.3.2中阳性结果的，判定为鸡红螨病阳性。10.1.2不符合8.3.2中疑似鸡红螨形态特征，但符合9.3.2中阳性结果的，需要重复9.2中的PCR扩增，若重复扩增仍符合9.3.2中阳性结果的，判定为鸡红螨病阳性。10.2.1不符合8.3.2中疑似鸡红螨形态特征，且出现9.3.2中阴性结果的，判定为鸡红螨病阴性。10.2.2符合8.3.2中疑似鸡红螨形态特征，但不符合9.3.2中阳性结果的，需要重复9.2中的PCR扩增，若重复扩增仍不符合9.3.2中阳性结果的，判定为鸡红螨病阴性。6T/CVMA230—2025溶液配置A.1电泳缓冲液（TAE）的配制A.1.150×TAE贮存液冰醋酸57.1mLTris-Base242g用800mL灭菌去离子水溶解，充分混匀后用灭菌去离子水补齐至1000mL，常温保存备用。A.1.21×TAE使用液50×TAE贮存液去离子水490mL混匀，常温保存备用。A.21.5%的琼脂糖凝胶琼脂糖干粉1×TAE使用液微波炉加热至琼脂糖熔化，待稍冷却后加入终浓度绿如蓝核酸染料，摇匀。7T/CVMA230—2025鸡红螨形态学鉴定A：鸡皮刺螨成虫（雌）；B：鸡皮刺螨颚体（雌）；C：鸡皮刺螨躯体（雌）；D：鸡皮刺螨躯体（雄）L1-L4：足1-足4；id：躯体；Pa：须肢；Ch：螯肢；dp:背板；sp:胸板；ap:肛板，ao:肛孔；gvp:生殖腹板；sgp:胸生殖板；vap:腹肛板；L:侧毛；由于螨体用氢氧化钠处理呈半透明状，所以背板和生殖腹板、肛板同时可见，图D箭头处为雄螨胸生殖板和腹肛板之间的一条横纹。图1鸡红螨形态学鉴定示意图8T/CVMA230—2025PCR反应体系配制及注意事项C.1PCR检测反应体系鸡红螨PCR检测反应体系见表C.1。表C.1鸡红螨PCR反应体系体积(µL）200ng/µL-C.218SrRNA·ITS·28SrRNA及线粒体细胞色素C氧化酶亚基1（Cox1）特异性引物序列鸡红螨18SrRNA·ITS·28SrRNA及线粒体细胞色素C氧化酶亚基1（Cox1）特异性引物序列见表C.2。表C.2鸡红螨特异性引物序列5,-AGTTCAGCGGGTCGTCACAC.3PCR反应程序鸡红螨PCR反应程序见表C.3。表C.3PCR反应程序19T/CVMA230—20251C.4注意事项C.4.1所有试剂应按要求分别在4℃、-20℃条件保存，使用时室温下融化后，放置于冰上。C.4.2由于阳性对照样品中模板浓度相对较高，在PCR反应体系配制过程中，阳性对照DNA与待检样品DNA应在不同区域添加。C.4.3PCR反应前，将反应液震荡混匀，离心。随后放置在设定程序后的PCR仪中，开始反应，共35个循环。T/CVMA230—2025鸡红螨PCR检测结果判定图D.1鸡红螨基于18SrRNA·ITS·28SrRNA位点PCR扩增结果鸡红螨基于18SrRNA·ITS·28SrRNA位点PCR扩增结果示意图见图D.1。M:DL-2000DNA相对分子质量标准；-：阴性对照；+：阳性对照；1~20：检测样品PCR产物图D.1鸡红螨基于18SrRNA·ITS·28SrRNA位点PCR扩增结果示意图D.2鸡红螨基于Cox1位点PCR扩增结果鸡红螨基于Cox1位点PCR扩增结果示意图见图D.2。M:DL-2000DNA相对分子质量标准；-：阴性对照；+：阳性对照；1-3：检测样品PCR产物图D.2鸡红螨基于Cox1位点PCR扩增结果示意图T/CVMA230—2025鸡红螨PCR扩增片段核酸序列E.1鸡红螨18SrRNA/ITS/28SrRNA基因序列全长片段（522bp,GenBankAccessionNo.LC034922.1）5,-TAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAATCAAAATCCATTCACTCACTCAGAGAGGATGGTACCTGTATGATGTGCTATCCCACGCTGTTGGGAGAGCCATTGCAATGTAATGACATGTATTCTAAATTTGTATCGCGTACTCACTTTACTAAGTTAGTCGCGTGTCGCCAGCCATCGGCTGGTTTGACAACAATTTTACCAATTTGTGCTATTGAGATTAAAAcAAAAcAAGACTCAATGTGGGGGATCACTTAGTCCTTAAATCGATGAAAAACATAGTAATTTGTGGAAAATGATGTGAGTTGTGAAATTTTGTGAGCATTGTGTTTTTGAATGAAAATTTCAGCATGGATGCATGCGTGTCTATGCTGCATTTGTTTCAGTATATATCAATGTCAATTTGTCGTTACTATTGOTTGAAAGCAATAGTATAAACTGTTCGCGATCACAAG