皮肤真菌感染实验室诊疗指南

皮肤真菌感染实验室诊疗指南一、标本采集与处理规范的标本采集是获得准确检测结果的前提，不同解剖部位的皮肤真菌感染需采用针对性采集方法，错误的采集方式可导致假阴性结果，概率可达30%~40%。（一）采集前准备1.患者准备：若采集前1周内局部使用过抗真菌药物，需停药后采集；累及毛发或头皮的感染，采集前1天避免洗头，减少表面污染物干扰。2.器械准备：采用75%乙醇消毒采集区域皮肤，禁用碘伏，避免碘剂染色干扰镜检结果；准备消毒手术刀、刮刀、镊子、无菌纱布、10%KOH（氢氧化钾）制片液、无菌培养试管或培养平皿。（二）不同部位标本采集方法1.皮肤角质层、掌跖、体股部皮损：选择活动性边缘，即皮损炎症最明显的区域，用消毒刀片轻刮去除表面已坏死脱落的角质层，直至出现轻微渗血的真皮上层，刮取新鲜鳞屑放入无菌容器，采集量不少于5mg；若为水疱型损害，需刮取水疱边缘的疱壁组织，避免采集疱液，疱液中真菌含量极低，假阴性率超过60%。2.甲真菌病标本：根据感染类型调整采集部位：浅表白色甲真菌病刮取病甲表面白色浑浊角质；远端侧位甲下型甲真菌病需先剪除病变指甲，刮取甲床与甲板结合部位的甲下碎屑；近端甲下型需用刀片削除甲板表层，获取近端甲下组织。采集量不少于10mg，仅采集甲板表层组织的假阴性率为45%~70%。3.毛发标本：断发毛癣菌、紫色毛癣菌等感染易出现断发，选择发根部位距离头皮2cm以内的断发，至少采集10根；黄癣采集带有黄癣痂的病发，白癣采集头部荧光发亮的鳞屑斑区病发；头癣脓肿期避免采集脓性渗出物，需采集脓肿周边的病发，脓性渗出物真菌培养阳性率不足10%。4.深部皮肤真菌感染：如孢子丝菌病、着色芽生菌病，需采用穿刺或活检获取真皮及皮下组织，避免仅采集表面溃疡渗出物，组织块体积不小于3mm×3mm×2mm，置于无菌生理盐水中保湿送检。（三）标本运送与保存皮肤真菌属于需氧生长的嗜角质真菌，标本采集后需在2小时内送检，室温放置不超过24小时；若无法及时送检，可置于4℃冰箱保存，保存时间不超过7天，超过7天真菌活性下降，培养阳性率降低15%~25%；禁止冷冻保存，低温会导致菌丝和孢子坏死，完全丧失培养活性。二、直接镜检技术直接镜检是皮肤真菌感染的一线快速诊断方法，操作简单，1小时内即可获得结果，阳性可直接确诊真菌感染，阴性不能排除感染。（一）常用方法1.10%KOH湿片法：是临床最常用的方法，具体操作：将采集的标本置于载玻片上，滴加1滴10%KOH溶液，覆盖盖玻片，置于酒精灯火焰上微加热1~2秒，不可煮沸，室温放置5~10分钟待角质溶解，轻压盖玻片排出气泡后镜检。可在KOH中加入0.1%的锥虫蓝染色，真菌染成蓝色，背景透明，阳性检出率提高12%~18%。2.乳酸酚棉蓝染色法：染色液配方为苯酚20g、乳酸20ml、甘油40ml、棉蓝0.05g、蒸馏水20ml。将标本染色后可长期保存，真菌菌丝和孢子被染成深蓝色，折光性强，更容易观察，适合浅部真菌的形态鉴定，检测灵敏度为70%~80%，高于KOH湿片法。3.荧光染色法：常用的为卡氏荧光白染色，荧光白可特异性结合真菌细胞壁的几丁质和纤维素，在荧光显微镜下发出亮蓝色荧光，检测灵敏度可达85%~90%，较KOH湿片法提高20%左右，对于低真菌载量的标本（如甲真菌病、头癣）优势明显，缺点需要配备荧光显微镜，检测成本略高。（二）结果判读1.阳性结果判读：镜下发现透明分隔分枝菌丝、关节孢子、圆形或卵圆形芽生孢子即可判定为阳性：①皮肤癣菌病多可见分隔分枝菌丝，关节孢子多见于毛发内感染；②念珠菌感染可见假菌丝和出芽孢子；③花斑糠疹可见弧形短菌丝和成簇圆形厚壁孢子，即“spaghettiandmeatballs”表现；④着色芽生菌病可见厚壁棕色分隔孢子。2.阴性结果判读：未发现真菌成分即为阴性，影响阴性结果的因素包括：标本采集不合格、真菌载量低、抗真菌药物使用后真菌变形无法识别，因此直接镜检阴性需结合培养结果或分子生物学检测进一步确认。（三）质量控制每次检测需设置阳性对照，用已知的红色毛癣菌阳性标本验证染色和镜检系统；KOH溶液需每3个月更换一次，避免污染导致假阳性。直接镜检检测的灵敏度：体股癣为70%~80%，甲真菌病为40%~70%，头癣为50%~75%，临床需根据部位合理判读。三、真菌分离培养与鉴定分离培养是皮肤真菌感染诊断的金标准，可明确致病真菌种类，指导临床选择抗真菌药物，并进行药物敏感性试验，培养阳性率可达70%~90%，高于直接镜检。（一）培养基选择1.沙堡弱葡萄糖琼脂（SDA）：是最常用的基础分离培养基，配方为葡萄糖40g、蛋白胨10g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH调整为5.6±0.2，添加氯霉素0.5mg/ml抑制细菌生长，添加放线菌酮0.5mg/ml抑制污染真菌（如曲霉、青霉）生长，适合浅部皮肤癣菌的分离培养。2.马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：适合真菌产孢和菌落形态鉴定，促进孢子形成，有利于皮肤癣菌、暗色真菌的形态学鉴定。3.脑心浸液琼脂（BHI）：适合深部致病真菌如孢子丝菌、组织胞浆菌的生长，可提高阳性分离率10%~15%。4.念珠菌显色培养基：针对皮肤黏膜念珠菌感染，可直接通过菌落颜色鉴定菌种：白色念珠菌呈绿色，热带念珠菌呈蓝灰色，光滑念珠菌呈无色或淡紫色，克柔念珠菌呈粉红色，鉴定准确率可达90%以上，无需进一步生化试验。（二）培养条件皮肤真菌多数为嗜温嗜氧菌，培养温度设置为25℃~28℃，深部真菌如皮炎芽生菌、组织胞浆菌可同时设置37℃培养；初始分离培养时间：浅部真菌培养2周，每周观察2次，无生长方可报告阴性；甲真菌病标本需延长培养至4周，部分缓慢生长的真菌如紫色毛癣菌需要3~4周才能形成可见菌落；深部真菌感染培养时间延长至6周。培养过程中需保持培养基湿度，避免干燥影响真菌生长。（三）菌种鉴定方法1.形态学鉴定：是目前临床最常用的鉴定方法，根据菌落形态、颜色、生长速度，结合镜下大分生孢子、小分生孢子的形态特征鉴定：①红色毛癣菌：菌落呈红色绒毛状，背面红色，小分生孢子呈侧生棒状，大分生孢子较少，呈铅笔状；②须癣毛癣菌：菌落呈淡黄色颗粒状或绒毛状，背面棕黄色，大分生孢子呈棒状，分隔多，可见螺旋菌丝；③犬小孢子菌：菌落呈白色绒毛状，背面橙黄色，大分生孢子呈纺锤形，厚壁，有粗糙小刺；④断发毛癣菌：菌落生长慢，呈紫色或棕色，小分生孢子呈葡萄状，大分生孢子罕见；⑤申克孢子丝菌：25℃培养呈酵母样菌落，镜下可见梅花形排列的小分生孢子，37℃培养为酵母型，可见卵圆形芽生孢子。2.生化鉴定：主要用于酵母菌鉴定，包括糖发酵试验、碳源同化试验，API20CAUX酵母鉴定系统，准确率可达95%以上，可鉴定30余种常见致病酵母菌。3.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）：是近年来快速发展的真菌鉴定技术，通过检测真菌蛋白质图谱与数据库比对实现菌种鉴定，鉴定时间仅需要数分钟，对于常见皮肤致病真菌鉴定准确率可达92%~98%，可鉴定超过200种致病真菌，缺点是设备成本较高，尚未在基层普及。4.分子生物学鉴定：针对形态学难以鉴定的菌株，通过测序真菌ITS区域（内转录间隔区）、28SrRNAD1/D2区域实现准确鉴定，鉴定准确率接近100%，是疑难菌株鉴定的金标准，对于罕见真菌感染、耐药真菌感染的诊断有重要价值。（四）污染菌判断临床培养中约10%~15%的分离株为环境污染菌，如青霉、曲霉、链格孢，判断标准为：同一标本多次培养均为同一种真菌，或直接镜检发现相同真菌成分方可判定为致病菌；仅一次培养分离出污染菌，直接镜检阴性，无临床感染证据，判定为污染。四、非培养诊断技术非培养诊断技术适合无法进行培养或者直接镜检阴性的疑似病例，可缩短诊断时间，提高阳性检出率。（一）血清学检测1.1,3-β-D-葡聚糖试验（G试验）：检测真菌细胞壁的1,3-β-D-葡聚糖，适合侵袭性真菌感染的辅助诊断，对于播散性皮肤念珠菌病、曲霉感染诊断灵敏度为70%~90%，特异度为80%~90%，临界值为≥60pg/ml，结果阳性提示真菌感染，阴性不能排除，荚膜组织胞浆菌、隐球菌感染可出现假阴性。2.半乳甘露聚糖试验（GM试验）：主要用于侵袭性曲霉感染诊断，皮肤曲霉病诊断灵敏度为80%左右，特异度为90%，临界值为≥0.5。3.抗体检测：对于孢子丝菌病、组织胞浆菌病、芽生菌病等深部皮肤真菌感染，检测血清特异性IgG抗体，灵敏度可达80%~90%，适合慢性感染的辅助诊断，急性感染早期抗体阴性，需要结合其他检测结果。（二）核酸检测技术1.聚合酶链反应（PCR）技术：普通PCR可直接从临床标本中扩增真菌特异性基因片段，检测灵敏度可达10fg真菌DNA，对于直接镜检和培养阴性的甲真菌病、头癣，阳性检出率可提高20%~30%；实时荧光定量PCR可定量检测真菌载量，判断感染活动程度，监测治疗反应。2.多重PCR技术：可同时检测数种常见致病真菌，如同时检测红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌、念珠菌，适合临床快速筛查，检测时间仅需要4~6小时，远短于培养的2~4周。3.宏基因组高通量测序（mNGS）：对于疑难罕见的深部皮肤真菌感染，可直接从组织标本中检测所有病原真菌的核酸序列，无需培养，可发现罕见致病真菌，诊断灵敏度高于传统方法，适合经验性治疗无效、病因不明的慢性皮肤溃疡、结节性真菌感染的诊断，缺点是成本较高，无法区分污染菌和致病菌，需要结合临床判读。（三）皮肤镜与反射共聚焦显微镜检查皮肤镜检查可用于头癣、甲真菌病的辅助诊断，头癣在皮肤镜下可见“逗号状发”“螺旋状发”“折断发”，诊断灵敏度可达85%以上；甲真菌病可见甲下碎屑、甲板纵纹、黄棕色条纹，诊断符合率可达70%~80%。反射共聚焦激光扫描显微镜（RCM）可在体观察皮肤组织中的真菌结构，无需活检，可看到真皮内的酵母细胞、菌丝结构，对于着色芽生菌病、孢子丝菌病的辅助诊断有一定价值，诊断灵敏度约80%。五、抗真菌药物敏感性试验抗真菌药物敏感性试验可为临床耐药真菌感染治疗提供依据，随着外用抗真菌药物的广泛使用，皮肤癣菌的耐药率逐渐上升，我国2022年临床监测数据显示，红色毛癣菌对特比萘芬的耐药率为3.5%~5%，对伊曲康唑的耐药率约2%，规范的药敏试验对临床治疗有重要指导意义。（一）常用方法1.CLSIM38-A2方案：是临床实验室标准化协会推荐的丝状真菌药敏试验标准方法，采用肉汤稀释法，测定最低抑菌浓度（MIC），结果重复性好，是目前的金标准方法，适合皮肤癣菌、暗色真菌等丝状真菌的药敏试验。2.CLSIM27-A3方案：针对酵母菌的药敏试验标准方法，测定念珠菌、隐球菌等酵母菌的MIC值。3.纸片扩散法：操作简单，成本低，适合基层实验室初步筛查耐药菌株，结果判断根据抑菌圈直径大小分为敏感、中介、耐药，准确性略低于稀释法。4.E-test法：是梯度稀释法，可直接读取MIC值，操作简便，准确性接近肉汤稀释法，适合少量菌株的药敏试验，成本高于纸片扩散法。（二）结果判读目前皮肤真菌药敏试验尚无统一的临床折点，参考CLSI推荐的浅部真菌折点标准：①特比萘芬MIC＞0.5μg/ml判定为耐药，≤0.5μg/ml判定为敏感；②伊曲康唑MIC＞1μg/ml判定为耐药，≤0.25μg/ml判定为敏感；③氟康唑MIC＞16μg/ml判定为耐药，≤8μg/ml判定为敏感；④酮康唑MIC＞1μg/ml判定为耐药，≤0.25μg/ml判定为敏感。对于药敏结果耐药的菌株，需要更换药物种类，避免治疗失败。六、特殊类型皮肤真菌感染的实验室诊断要点（一）甲真菌病甲真菌病由于甲板角质致密，真菌载量低，直接镜检阳性率仅为50%~70%，培养阳性率为60%~80%，对于临床疑似甲真菌病，直接镜检阴性的病例，建议采用PCR检测或者延长培养时间至4周，提高阳性检出率；甲标本采集时必须获取甲下碎屑，仅采集甲板表层会导致假阴性。我国甲真菌病主要致病菌为红色毛癣菌，占所有致病菌的60%~70%，其次为须癣毛癣菌、念珠菌，占10%~15%。（二）头癣头癣好发于儿童，直接镜检可见发内或发外孢子，Wood灯检查可辅助分型：犬小孢子菌感染发出亮绿色荧光，断发毛癣菌无荧光，黄癣发出暗绿色荧光，可快速初步分诊；培养阳性率可达85%左右，采集病发时优先选择折断的发根标本，避免采集长发干，可提高阳性率；我国头癣致病菌谱已经发生改变，近年来犬小孢子菌占比上升至50%~60%，取代断发毛癣菌成为首位致病菌，与家庭宠物饲养增多密切相关。（三）慢性皮肤黏膜念珠菌病慢性皮肤黏膜念珠菌病多存在免疫缺陷，致病菌多为白色念珠菌，部分为非白念，如光滑念珠菌、克柔念珠菌，对氟康唑天然耐药，因此必须进行菌种鉴定和药敏试验，指导临床选择药物；念珠菌显色培养基可快速鉴定常见菌种，准确率可达90%以上。（四）深部皮肤真菌病包括孢子丝菌病、着色芽生菌病、暗色丝孢霉病、组织胞浆菌病等，标本需要采集真皮组织，培养时间延长至4~6周，直接镜检可见特征性的孢子结构，如孢子丝菌可见卵圆形芽生孢子，着色芽生菌病可见硬壳小体；血清抗体检测对于孢子丝菌病诊断灵敏度可达80%以上，对于培养阴性的病例有较高诊断价值；疑难病例可采用分子测序或者mNGS明确诊断。七、实验室诊断流程与质量控制（一）标准诊断流程1.第一步：临床疑似皮肤真菌感染，首先采集合格标本，进行直接镜检，直接镜检阳性结合临床表现即可确诊真菌感染，启动经验性治疗，同时进行培养鉴定菌种，必要时行药敏试验。2.第二步：直接镜检阴性，临床高度疑似感染，进行真菌分离培养，培养阳性鉴定菌种后确诊，培养阴性可采用非培养方