CN119410678A 一种用于优化抗体表达的方法 （Ambrx公司）

201980041409.92019.05.012ii.包含分配B(parB)基因座的核酸序列，所述分配B(parB)基因座具有SEQIDNO:12肽序列的Skp伴侣蛋白和/或所述核酸序列编码具有如SEQIDNO:16所示的多肽序列的ii.一种核酸序列，所述核酸序列具有处于编码所述重组蛋白的核酸序列的上游的iii.一种核酸序列，所述核酸序列具有处于编码所述重组蛋白的核酸序列的下游的4.如权利要求1_3中任一项所述的载体，其中所述编码伴侣蛋白的核酸序列包含所述ii.所述编码FkpA伴侣蛋白的核酸序列包含如Sii.所述编码FkpA伴侣蛋白的核酸序列包含如S3所述parB基因座的核酸序列以及编码所述伴侣蛋白的核酸序列包含在具有天然启动子的所述parB基因座的核酸序列以及编码所述伴侣蛋白的核酸序列包含在具有诱导型启动子11.如权利要求10所述的载体，其中所述抗体重链C一末端延伸变体选自CH1一D延伸、15.如权利要求13所述的载体，其中所述抗体片段是抗CD3Fab，并且其中所述抗CD3Fab在所述重链恒定结构域(CH1)位置129中的赖氨酸(K)残基处位点特异性掺入对乙酰基16.如权利要求13中任一项所述的载体，其中所述非天然编码的氨基酸是O甲基L419.如权利要求18所述的重组细胞或细胞系，用于优化所述重组细胞或细胞系中的质21.如权利要求20所述的重组细胞或细胞系，其中所述非天然编码的氨基酸是对乙酰22.一种产生包含位点特异性掺入的非天然编码的氨基酸的重组蛋白的方法，所述方23.如权利要求22所述的方法，所述方法用于提高包含位点特异性掺入的非天然编码24.如权利要求23所述的方法，其中所述包含位点特异性掺入的非天然编码的氨基酸5基L苯丙氨酸或对炔丙基氧基苯丙氨酸。6于优化抗体表达的方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/[0004]本申请含有已通过EFS一Web以ASCII格式提交并且特此以引用的方式整体并入的[0005]本公开涉及分子生物学领域。本发明公开内容涉及载体和质粒的设计和工程的旁路途径包括截短、错误折叠、聚集和蛋白水解(MiotM.和BettonJ.M.,Microbial[0008]大肠杆菌中的许多种类的辅助蛋白和/或因子用于帮助产生处于其正确折叠和活达已被用于增加大肠杆菌中的异源蛋白质(包括抗体片段)的效价(Thomas等人,AppliedBiochemistryandBiotechnology,66,197,1997；Kolaj等人,MicrobialCell[0010]为了克服表达难以表达(DTE)蛋白质所面临的挑战，本发明在载体和由所述载体产生的质粒的设计和工程化中利用辅助蛋白和/或因子(包括伴侣蛋白)以实现非天然编码7新颖表达质粒和相应的生产菌株用于蛋白质表达优化和效价产量。在本发明的实施方案但不限于大肠杆菌)中的蛋白质表达的方法和表达质粒以及些组分中的两种或三种或更多种可与目标蛋白质一起包含在质粒中。在一些实施方案中，所有组分可包含在具有天然启动子的单一表达质粒中或包含在具有诱导型启动子的两个在Zra1位点处或在Afe1位点处。在其他实施方案中，所述质粒含有271个碱基对的序列缺8含5个或更多个其中具有至少一个突变的氨基酸或由5个或更多个其中具有至少一个突变9体片段(scFv)、二硫化物稳定化的scFv(dsFv))、[0022]在一个实施方案中，所述工程化的生产菌株或细胞是2797、2835、2884、2885、所述重组细胞包含伴侣蛋白FkpA和分配B基因座(parB)。所述细胞选自菌株2909、2840、或抗体片段的表达效价可包括相对于起始菌株，使表达产量优化或增加至少蛋白_2、单核细胞趋化蛋白_3、单核细胞炎性蛋白_1α、单核细胞炎性蛋白_1β、RANTES、子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶酮基或氨基取代的氨基酸或它们的所述分离的细胞或细胞系用于产生含非天然氨基酸的蛋白质或多肽。在另一个实施方案基因座以反转录取向位于编码目标蛋白质的核酸序列的Afe1位点处。在其他实施方案中。所述分离的细胞或细胞系优化生产细胞或细胞[0032]2.如实施方式1所述的载体，其中所[0037]7.如实施方式1所述的载体，其中pa[0038]8.如实施方式1所述的载体，其中parB[0039]9.如实施方式1所述的载体，其中pa[0050]20.一种重组细胞，所述重组细胞包含[0052]22.如实施方式20所述的重组细胞，其中所[0059]29.一种产生掺入非天然编码的氨基酸的目[0060]30.如实施方式29所述的方法，所述方基L苯丙氨酸或对炔丙基氧基苯丙氨酸。[0066]34.如实施方式33所述的分离的[0067]35.如实施方式求29所述的分离的细胞[0068]36.如实施方式35所述的分离的细胞或细胞[0069]37.如实施方式35所述的分离的明公开内容的原理的说明性实施方案的详细描述以及所提供的附图将获得对本发明的特[0076]图4.具有质粒p96的生产菌株2835和具有亲本质粒p56的亲本菌株2797的发酵效株2884(p117)和2885(p118)中，parB基因座分别以For或Rev取向克隆在AfeI限制酶位点。[0078]图6.在parB基因座的最佳位置和取向情况下示出的菌株2886中所含的质粒p119[0079]图7A_B.用于测试周质伴侣蛋白表达的影响的相容的两质粒(图7A)对比单质粒[0080]图8.在相容的两质粒表达系统中，两种表达周质伴侣蛋白的菌株(菌株2840和菌株2910(p135))以及亲本菌株2886(p119)的发酵[0082]图10.在FkpA伴侣蛋白和parB基因座的位置和取向情况下示出的菌株2909中所含[0083]图11.表达在质粒中的位置和取向不同的辅助[0084]图12A_B.来自捕获于CaptoS柱洗脱级分中的菌株2886的Fab重链(图12A)和轻链(图12B)的各种翻译截短的(虚线箭头)和蛋白[0085]图13A_B.各种重链(HC)羧基_末端(C_末端)延伸变体的可恢复效价(图13A)和纯学性术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相过肽接头共价连接(Hu等,CancerResearch,56,3055_3061,1996)。这些小(Mr25,000)蛋片段是双抗体(Db)、BiTE(双特异性T细胞衔接原分子内或分子间二硫键的任何化合物或材料。合适的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物引起蛋白质的可逆解折叠的任何化合物或材料。变性剂(denaturingagent)或变性剂领域的普通技术人员将认识到天然或非天然核酸中一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的UGG以外)可被修饰以获得功能上相同的分andMolecularPropert处于均质状态，或者分离的组分可以是包含另外的药学上可接受的载体和/或赋形剂的药[0104]“非天然氨基酸”是指不是20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而天然存在，但它们自身不通过翻译复合但不限于(i)天然核苷酸的与参考核酸具有类似结合性质，并且以与天然存在的核苷酸类生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸的氨所述天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可在细胞干重的约30％、约25％、约20％、约菌碱性磷酸酶(phoA)启动子驱动的双顺反子调控区域(增强子、沉默子、边界元件/绝缘RNA分子可例如通过掺入RNA依赖性DNA聚合酶的逆转录过程来编码DNA分子。在另一方面，存在所述肽或核酸分子的细胞的其他组分(如重组肽或核酸分子的表达宿主细胞)分离的在内含子、信息上限以及poly_AmRNA和其他生物化学特征，如有区别的核糖体结构。如在Maniatis等人,MolecularCloning,AlaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1982或在Ausubel等人,Currentprotocolsinmolecularbiology,JohnWileyandSons,1994分子结合的技术。重组DNA分子通常通过遗传工程化中的实验产生。同义词包括“遗传剪[0126]如本文所用的术语载体或构建体是指能够转运已引入载体的非载体核酸序列的他载体可在引入宿主细胞中后整合至所述宿主细胞的基因组中，且与宿主基因组一起复通常是环形且双链的，并且可天然存在于细菌中，并且有将如上文定义的质粒引入宿主中。关于原核宿主细胞的转化，参见例如，Cohen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA69,2110,1972和Sambrook等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual,增刊第3版ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,至另一宿主分子的序列。达盒，所述重组或合成DNA分子含有所需的编码序列和在特定宿主生物体中表达可操作连[0133]本发明利用一种或多种参与蛋白质表达的遗传元件，包括难以表达的(DTE)蛋白质(包括抗体片段)的效价增加(Thomas等人,AppliedBiochemistryandBiotechnology66,197,1997；Kolaj等人,MicrobialCellFactories,2009；Merdanovic等人,并且肽基脯氨酰基异构化已被提议作为HC折叠的限速步骤(Feige等人,Mol.Cell34,569,[0135]本发明在载体和由所述载体产生的质粒的设计和工程化中利用辅助蛋白和/或因子或遗传元件以实现掺入非天然氨基酸的蛋[0136]在本领域中众所周知，若干辅助蛋白和/或因子(包括蛋白折叠因子和伴侣蛋白)瞬时相互作用促进适当的异构化和细胞靶向；并且折叠酶加速沿着折叠路径的限速步骤。菌理想地充当以低成本和高产量产生异源蛋白质的宿主，因为它可容易地生长至高密度，若干蛋白质折叠因子和伴侣蛋白的周质定位可催化功能性蛋白质(如抗体片段)的正确组[0138]用于提高低至不良蛋白质产量的另一种方法是利用参与恢复重组蛋白质产物的溶解度和功能并在周质抗体片段表达过程中影响细胞代谢的辅助蛋白质和/或因子，包括白和/或因子(如伴侣蛋白)与目标蛋白的共表达可增加可溶性蛋白的水平。在一个实施方施方案中，所述一种或多种能够促进蛋白质分泌或易位的蛋白质是SecY、SecE、SecG、[0139]已显示周质伴侣蛋白，包括但不限于Skp和FkpA可改善抗体片段的周质产生(Hayhurst等人,ProteinExpr.Purif.,15,336–343,1999；Hayhurst等人,具有重新折叠错误折叠的蛋白质并防止其聚集成周质中的不溶性包涵体的一般能力的分子伴侣。Skp是可促进新合成的外膜蛋白的正确折叠并有助于维持其溶解度的17_kDa的同源三聚体蛋白；并且FkpA是表现出伴侣蛋白活性和肽基_脯氨酰基异构酶(PPlase)活性的基之间的二硫键形成和断裂的酶。在大肠杆菌中，此类二硫化物异构酶(辅助蛋白)包括生含异源二硫键的多肽的方法，其中原核二硫化物异构酶如DsbC或DsbG与真核多肽共表一者的多核苷酸以用于产生外源蛋白质；EP专利号0786009公开了一种用于在细菌中产生如在本领域中针对FkpA所观察到。[0141]本领域已知在一些细菌质粒分离系统中，称为质粒分配位点(par)的特定基因参与杀死在细胞分裂过程中丢失质粒的子细胞(EbersbachG.和GerdeR1的580_bp的最小分配B(parB)位点在许多细菌(包括大肠杆菌)中介导维持性和稳定性互补的小的反义RNA。编码hok基因活性的反式作用拮抗剂的sok基因(抑制杀伤)位于整个[0142]蛋白酶在转化大肠杆菌周质和细胞质中的旧的和错误折叠的蛋白质中起重要作性蛋白酶(Tsp))是造成Fab裂解的原因(ChenC.等人Biotechno折叠区域裂解(Keiler等人ProteinScience19954,1507)。裂解位点由蛋白质二级或三量(KeilerKC和SauerRT,TheJournalofBiologicalChemistry1996271,2589)。因大肠杆菌中的使用是本领域众所周知的。这种技术使用了在原核物种中起作用的正交007870和WO2005/007624，其内容以引用的方式整体并入。还参见，Wang和Schultz,"编码目标蛋白质(或基因)的多核苷酸改工程化为含有标志非天然氨基酸掺入的选择因子的所需特征包括仅解码或识别不被任何内源性tRNA解码的特定密码子(例如选择因子密码子)的tRNA，以及优先使其具有仅一种特异性非天然氨基酸的同源tRNA氨基酰化(或“带[0147]已经报告了几个其他正交对。源自酿酒酵母tRNA和合成酶的谷氨酰胺酰基(参见Helv.Chim.Acta83:2277_2286)和酪氨酰基(参见例如，Ohno等人,(1998)J.Biochem.(Tokyo,Jpn.)124:1065_1068；非天然氨基酸潜在掺入大肠杆菌中进行了描述。源自大肠杆菌谷氨酰胺酰基(参见例如，Kowal等人,(2001)PNAS98:2268_2273)和酪氨酰基(参见例如，Edwards等人,(1990)(2002)NucleicAcidsRes.30:4692_46码的O_tRNA的抑制效率相比，在响应于选择因子密码子的同源合成酶存在下包括至少约tRNA氨基酰化。所述细胞使用O_tRNA/O_RS对来将非天然氨基酸掺入生长中多肽链中，例[0149]本发明的选择因子密码子扩展了蛋白质生物合成机制的内掺入一种或多种非天然氨基酸。例如，产生O_tRNA，其识别终止密码子(包括但不限于UAG)并被具有所需非天然氨基酸的O_RS氨基酰化。天然存在的宿主的氨酰基_tRNA合成酶括但不限于TAG。参见例如，Sayers,J.R.,等人(1988),5’_3’Exonucleasesinphosphorothioate_basedoligonucleotide_directedmutagenesis.NucleicAcids于对UAG密码子的抑制效率取决于O_tRNA(包括但不限于琥珀抑制基因tRNA)与真核释放因子(包括但不限于eRF)(其结合至终止密码子并起始生长中肽从核糖体的释放)之间的竞争，所述抑制效率可通过(包括但不限于)增加O_tRNA和/或抑制基因tRNA的表达水平进行如四碱基、五碱基、六碱基或更多碱基密码子。四碱基密码子的实例包括但不限于AGGA、环(例如具有至少8_10nt反密码子环)的突变O_tRNA(包括但不限于特殊移码抑制基因胞中编码多种非天然氨基酸。参见Anderson等人,ExploringtheLimitsofCodonandAnticodonSize,ChemistryandBiology,9:237_244.2002；Magliery,ExpandingtheGeneticCode:SelectionofEfficientSuppressorsofFour_baseCodonsandIdentificationof“Shifty”Four_baseCodonswithaLibraryApproachinEscherichiacoli,J.Mol.Biol.307:755_769在体外将2_萘丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时掺入链霉抗生物素蛋白中。(参见例如，的tRNALeu解码，效率为13％至26在0或–1帧中几乎没有解码。参见Moore等人,的非天然碱基对的描述包括，例如Hirao,等人,Anunnaturalbasepairforincorporatingaminoacidanaloguesintoprotein,NatureBiotechnology,20:177一mutRNATyrSS12TyrRS对、mutRNALeumutLeuRS对、mutRNAThrmutThrRS对、mutRNAGlu[0159]本公开包括具有特异性掺入其中的非天然或不天然编码的氨基酸位点的抗体片或硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸中的一种的任何氨基酸、经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似解或光可裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长的酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。示例性苯丙氨酸类似物包括但不限于间位取代的苯丙氨酸，丙基L苯丙氨酸等。[0162]以上提供的许多非天然氨基酸是可商购的，例如，可从Sigma(USA)或Aldrich准方法任选地合成不可商购的那些。对于有机合成技术，参见例如，Fessenden,R和Fessenden,J,OrganicChemistry,第二版,WillardGrantPress,BostonMass.,1982；March,J.,AdvancedOrganicChCarey,F.和Sundberg,R.,AdvancedOrganicChemistry,第三Glutamineandofgamma一DipeptidesofGlutamicAcidfromPhthylatedIntermediates,J.Chem.Soc.,3315一3319,1949；Friedman,O.M.和Chatterrji,R.,SynthesisofDerivativesofGlutamineasModelSubstratesforAnti一TumorFrappier,F.,GlutamineanaloguesasPotentialAntimalarials,Eur.2015,1991；Koskinen,A.M.P.和Rapoport,H.Synthesisof4SubstitutedProlinesasConformationallyConstrainedAminoAcidAnalogues,J.Org.Chem.,54,1859一1866,1989；Christie,B.D.和Rapoport,H.,SynthesisofOpticallyPurePipecolatesfromLAsparagine.ApplicationtotheTotalSynthesisof(+)ApovincaminethroughAminoAcidDecarbonylationandIminiumIonCyclization,J.Org.Chem.1989:1859_1866,1985；Barton等人,SynthesisofNovela_Amino_AcidsandDerivativesUsingRadicalChemistry:SynthesisofL_andD_a_Amino_AdipicAcids,L_a_aminopimelicAcidandAppropriateUnsaturatedDerivatives,TetrahedronLett,43:4297_4308,1987；以及Subasinghe等人,Quisqualicacidanalogues:synthesisofbeta_heterocyclic2_aminopropanoicacidderivativesandtheiractivityatanovel酶抗性等。包含非天然氨基酸的蛋白质可具有增强的或甚至全新的催化或生物物理性质。(2000)UnnaturalAminoAcidsasProbesofProteinStructureandFunction,CurrentOpinioninChemicalBiology,4:645_6不限于在所述蛋白质中可存在对于具有多于一种非天然氨基酸的给定蛋白质使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一种非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂有至少一种非天然氨基酸的目标蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常将包含真核翻译后修择性修饰的大多数反应涉及亲核和亲电反应配偶体之间的共价键形成，包括但不限于_卤然的酮基_氨基酸与酰肼或氨基氧基化合物的反应。参见例如，Cornish等人,(1996)recombinantproteinsforchemoselectivemodificationbytheStaudingerligation,PNAS99:19_24,是编码蛋白质的核酸)用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域普通技术人员已知的并且描述于例如Sambrook等人和Ausubel[0170]本发明的重组宿主细胞提供了合成包含大量有用量的非天然氨基酸的蛋白质的信号肽(鼠Igĸ轻链信号肽)。其他信号肽包括但不限人,Nature289,643_646,1981)、经修饰的羧肽酶信号肽(Valls等人,Cell48,887_897,[0172]细菌表达技术是本领域普通技术人员已知的。各种各样的载体可用于细菌宿[0173]细菌启动子是能够结合细菌RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)的下游为操纵子的第二结构域，所述第二结构域可与RNA合成开始的相邻RNA聚合酶结合位点重因激活蛋白结合序列来实现正调控，所述基因激活蛋白结合序列(如果存在的话)通常在RNA聚合酶结合序列的近端(5')。基因激活蛋白的一个实例是分解代谢物激活蛋白(CAP)，其可帮助起始lac操纵子在大肠杆菌(E.coli)中的转录(Raibaud等人,Annu.Rev.Genet,意突变，单个亲本细胞的子代并不一定与原始亲本在形态或基因组或全DNA补体方面完全相同。此定义所预期的子代中包含与亲本足够利福尼亚大学生物物理学和医学物理系细菌遗传储备中心(BacterialGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia通常使用源自K菌株的细菌(例如W3110)或源自B菌株的细菌(例如BL21)。这些菌株特别有适当表达构建体的宿主细胞)，就在适合于目标蛋白质或多肽产生的条件下培养重组宿主防止不良微生物和/或化合物的生长，包括但不限于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生蛋白质的情况下，可添加包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱导部分可溶性蛋白[0179]然后可使用本领域已知的许多合适的增溶剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀的领域普通技术人员已知的标准技术可用于破坏宿主细胞并从宿主细胞的细胞质或周质空[0182]本公开涵盖本领域众所周知的方法和常规技术。这些包括分子生物学的常规方献中进行了充分解释，如MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版(Sambrook等Synthesis:MethodsAndApplications(MethodsinMolecularBiology),(Herdewijn,P.,编辑,HumanaPress,Tot1984)；MethodsInMolecularBiology,(HumanaPress,Totowa,NJ)；CellBiology:(Mather,J.P.和Roberts,P.E.,编辑,PlenumPress,NewYork,NY,1998)；CellAndTissueCulture:LaboratoryProcedures(Doyle,A.等人,编辑,JohnWileyandSons,Hoboken,NJ,1993_8)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(Miller,J.M.等人编辑,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY,1987)；CurrentProtocolsInMolecularBiology(Ausubel,F.M.等人,编辑,GreenePub.Associates,NewYork1987)；PCR:ThePolymeraseChainReaction,(Mullis,K.等人,编辑,Birkhauser,Boston,MA,1994)；ShortProtocolsInMolecularBiology(JohnWileyandSons,Hoboken,NJ,1999)；Immunobiology7(Janeway,C.A.等人,GarlandScience,London,UK,PracticalApproach(D.Catty.,编辑,OxfordUniversityPress,USA,NewYork,NY,1989)；MonoclonalAntibodies:APracticalApproach(Shepherd,P.等人编辑,OxfordUniversityPress,USA,NewYorkNY,2000)；UsingAntibodies:ALaboratoryManual(Harlow,E.等人编辑,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1998)；TheAntibodies(Zanetti,M.等人编辑,HarwoodAcademicPublishers,London,[0183]本发明还涉及真核宿主细胞、非真核宿主细胞和用于经由正交tRNA/RS对体内掺入非天然氨基酸的生物体。用本发明的多核苷酸或包本发明的载体，其可以是例如克隆载体或表达载体)的构建体对宿主细胞进行遗传工程化包括受体细胞与含有DNA的细菌原生质体的融合、电穿孔、射弹轰击以及用病毒载体感染纯化的质粒进行进一步操作以产生其他质粒，用于转染细胞或掺入相关载体以感染生物Company(Midland,TX可在万维网获得)、TheGreatAmericanGeneCompany(Ramona,CA可在万维网获得)、ExpressGenInc.(Chicago,IL可在万维网标准订购。[0186]本文所述的任何组合物可在药盒中在合适的容器装置中可将用于设计和构建或工程化本发明的载体和/或质粒的所有或部分组分一起包装在药盒GibsonAssembly试剂盒(NewEnglandBiolabs，MA)的基于重组的克隆方法或通过使用QuikChange诱变试剂盒(AgilentTechnologies，CA)使本发明的抗CD3Fab表达质粒工程端具有与用于同源重组的受体载体序列的约18_24个碱基对(bp)的重叠序列，并在酶混合物PfuUltraIIHotstartPCRMasterMix(AgilentTechnologies,CA)进行扩载体通过在供应商推荐的温度下用独特的限制酶(NEB，MA)在载体中消化3至5小时来线性用GibsonAssembly试剂盒(NEB)在50℃下孵育15分钟，然后用于转化至大肠杆菌NEB5α菌[0195]通过将GibsonAssembly混合物铺板到含有适当抗生素的LB琼脂板上来回收重组过使用基因特异性测序引物验证了完整的GOI区域以及100bp上游和100bp下游序列。[0196]QuikChange诱变(QCM)：通过使用QuikChangeLightning定点诱变试剂盒(AgilentTechnologies)创建了含有TAG终止密码子的琥珀变体。使用QuikChangeWeb[0197]在PCR反应完成后，将混合物用试剂盒(AgilentTechnologies)附带的Dpn1酶在[0199]为了制备本发明的生产菌株，用序列验证的质粒DNA(50ng)转化化学感受态大肠杆菌W3110B60宿主细胞，在含有50μg/mL硫酸卡那霉素(Sigma)(或羧苄青霉素100μg/mL，三次划线并在37℃下孵育过夜，将来自新鲜转化板的单个菌落在含有50μg/mL硫酸卡那霉[0200]如上所述产生生产菌株的甘油小瓶后，通过DNA测序和抗生素抗性标记物的表型质粒进行了序列验证。用来自克隆的甘油小瓶的穿刺接种含有50μg/mL硫酸卡那霉素(或100μg/mL羧苄青霉素)的二十(20)mLLB，并在37℃、250rpm下生长过夜。使用QiagenMiniprep试剂盒分离质粒DNA，并通过DNA测序(EtonBiosciences,CA)确认分离的质粒中完整GOIORF的存在。素的LB和含有75ug/mL甲氧苄啶的LB。然后检查所有板的阳性生长，如在表1中公开的W3110B60生产宿主菌株的菌株基因型情况下所预[0203]用于生产抗CD3Fab_pAcF的发酵过程包括两个阶段：(i)接种物制备和(ii)发酵罐中的所有溶液在无菌添加之前均进行0.2μm过滤或高压灭菌。通过无菌转移接定OD600加氢氧化铵溶液或硫酸来控制pH。通过改变搅拌速度和增加喷射的空气/氧气混合物中的[0206]为了测量发酵样品的质粒保留，在收获时将甘油(20％v/v)的菌落的稀释板中挑选100个菌落，并将复制物铺板在2xYT+1％葡萄糖琼脂和2xYT+1％葡[0208]为了定量产物效价，在整个发酵过程中的不同时间点将1mL发酵液离心(18,000x(Novagen)化学裂解细胞糊，并各自在BugBuster蛋白质提取试剂(Novagen)中1:500稀释。混合物剧烈涡旋，然后在22℃下在Thermos振荡器上放置20分钟，同时以每分钟1000转抗CD3Fab的存在。然后将上述样品在酪蛋白缓冲液(ThermoFisher)中稀释，然后进行ELISA分析。将MSD板(MSD)用对抗CD3Fab的重链部分具有特异性的山羊抗人IgGFd液(MSD)稀释至1x，然后添加至每个孔中。通过相对于标准曲线外推来确定样品中抗CD3PVDF离心过滤器(Millipore)在18,000xg下过滤3分钟。然后将过滤的产物通过阳离子交液恢复。细胞溶解在4℃下进行。将细胞溶解在等于原始发酵体积的体积的100mM乙酸、上进行，以确定完整Fab对比在CaptoS柱上与完整Fab一起共纯化的另外修剪和截短的重链和轻链物种的纯度。可恢复效价也通过计算从CaptoS捕获柱中回收的蛋白质的总量且酵收获体积用于溶解和纯化时，将完整Fab的量除以初始CaptoS负载体积以估计发酵效柱上。流动相A由LC/MS级HPLC水中(Fis而流动相B由LC/MS级乙腈(FisherSci)中的0.05％LC/MS级TFA组成。具有与Agilent用AgilentMassHunter分析软件来定性地鉴定色谱分离的峰的质量。质谱蛋白质分析软件GPMAW用于测定抗CD3Fab蛋白一级序列的理论质量。将理论质量与测量的质量进行比链二者，指导Fab分泌到氧化周质中以获得正确折叠和二硫键形成。将琥珀终止密码子(TAG)在抗CD3Fab中的重链恒定结构域(CH1)位置129中的赖氨酸(K)残基129(本文下文称pAcFtyrRS/tRNA机器编码此位点处的pAcF(参见例如，WangL.等人,Sci[0217]表达载体的一般方案和相应的生产菌株构建：图2示出表达载体的一般方案及其包含在所述质粒中的tRNA簇的正交系统(参见例如，美国专利公布号：2003010885、平台生产宿主W3110B60菌株的染色体内的温度敏感性proS突变以确保质粒维持(描述于例试剂盒(NewEnglandBiolabs，MA)将工程化的Fab基因克隆到专有大肠杆菌表达载体中。重链和轻链的DNA和氨基酸序列在以下表3中示为SEQ.ID.No[0232]用于产生菌株2797的生产宿主细胞系W3110B60在基因组proS脯氨酸合成酶基因中的p56质粒还包含用于表达野生型大肠杆菌ProS蛋白的大肠杆菌proS基因。这使得能够程中的各个时间点收集的2797个细胞中[0233]为了确保在整个发酵运行过程中稳健的质粒维持，无论Fab生产温度或任何其他粒分配基因座(par)的特定基因通过杀死在细胞分裂过程中丢失了质粒的子细胞来确保这来自大肠杆菌质粒R1)可提高其在许多细菌(包括大肠杆菌)中的维持和稳定性(GerdesK.和NeilsenAl,J.Mol.Biol.因转录方向具有其宿主杀伤(hok)基因(SEQ.ID.NO:13)和氨基酸(SEQ.ID.NO:14)的正向[0239]然后在如上所述的高细胞密度发酵过程中比较生产菌株2797和2835。图4比较了短期和长期发酵条件下菌株2797和2835的生产效价。表6示出在两种不同的发酵过程中这胞密度发酵中与原始菌株2797进行了质粒保留和生产示克隆parB基因座的限制性酶位点，并且F(正向)表示hok基因的转录在与FabCDS相同的系与没有parB基因座的2797(抗CD3Fa[0246]如所预期的，所有4种新的parB细胞系在诱导后48小时均显示100％的质粒保留中的三种菌株(菌株2885、2886和2887)显示相对于27到在phoA启动子区域上游缺失质粒序列的部分对Fab效价具有负面影响(数据未示出)。通过将parB远离此区域重新定位并完整保留此序列可能支持在这些构建体中的大多数观察[0247]仅菌株2884具有低于对照菌株2797的细胞团块和培养基效价(图5A_5B)。本文所述的菌株2884与2835之间的唯一区别是具有相同parB_F取向的AfeI与NotI限制性酶位点[0248]为了确定最优化表达过程的最佳菌株，使用菌株2886和2887进行了进一步的研众所周知的具有肽基脯氨酰基异构酶活性的双功能周质伴侣蛋白FkpA和胞)的相容性质粒。将这些卡那霉素抗性(KanR)质粒与具有氨苄青霉素抗性(AmpR)和pBR322复制起点(30_50拷贝数/细胞)的抗CD3Fab表达质粒共转化，以测试周质伴侣蛋白[0252]对于此研究，考虑到标准生产宿主W3110B60菌株在染色体中系均用两种质粒共转化。质粒1在所有3个生产菌株中均含有抗CD3Fab+ampR+parB(其中parB克隆有AfeI与NotI限制性酶位点之间的271_bp缺失)。对于周质伴侣蛋白菌株2840和环素启动子(pTetA)后面，其中通过添加50份/十亿(ppb)的培养基中的四环素来诱导fkpA[0256]注意，所观察到的Fab表达改善的缺乏可能归因于周质伴侣蛋白的表达与它们的天然大肠杆菌启