第47讲　基因工程的基本工具和基本操作程序

17/17第47讲基因工程的基本工具和基本操作程序核心考点考题统计考情分析1.基因工程的基本工具2025·江苏卷T19 2024·湖南卷T5 2023·湖北卷T42023·重庆卷T121.命题特点：常以科研案例、生产或医学治疗为情境，结合免疫学应用、微生物培养、胚胎工程、遗传学、生理学等内容考查理解能力与实验探究能力。2.备考重点：掌握限制酶的作用与选用、表达载体的构建与转化、PCR技术与基因的获取及转基因的检测与鉴定、操作技术原理，外源基因表达及基因编辑等2.基因工程的基本操作程序2025·安徽卷T15 2025·河南卷T21 2025·黑吉辽蒙卷T252025·广东卷T21 2025·山东卷T25 2025·陕晋青宁卷T212025·四川卷T19 2025·甘肃卷T21 2025·浙江1月选考T242025·湖南卷T21 2025·河北卷T22 2025·安徽卷T203.DNA的粗提取与鉴定2025·江苏卷T23 2024·安徽卷T14 2024·山东卷T132023·广东卷T11 2023·福建卷T44.DNA片段的扩增和电泳鉴定2025·全国卷T6 2025·全国卷T34 2025·湖南卷T212025·河北卷T15考点一基因工程的基本工具1.基因工程的概念教材拾遗：〔选择性必修3P68“科技探索之路”〕肺炎链球菌的转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可在同种生物的不同个体之间转移；科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移；多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件；基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。2.基因工程的基本工具（1）限制性内切核酸酶——“分子手术刀”提醒：一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。（2）DNA连接酶——“分子缝合针”教材拾遗：〔选择性必修3P72“旁栏思考”〕DNA连接酶和DNA聚合酶不是一回事。①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。（3）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.通过基因工程技术引入外源基因可改变中国水仙花色。 （2024·福建卷）（）2.使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。 （2024·贵州卷）（）3.已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置。 （2020·浙江卷）（）4.将目的基因导入植物细胞可采用噬菌体作为载体。 〔选择性必修3P73正文〕（）1.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类（1）应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。（2）不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。（3）为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。2.根据质粒的特点确定限制酶的种类3.根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取（切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ），分析如下：4.巧用“同尾酶”：不同种限制性内切核酸酶识别序列各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端，则称为同尾酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。考查基因工程所需限制酶和DNA连接酶1.（2025·江苏高考19题改编）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为下列相关叙述正确的有（）A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变B.用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型相同C.用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致D.产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定题后归纳：与DNA有关的几种酶的比较考查载体的作用及特点2.（2023·新课标卷6题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（）A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接3.〔经典高考题改编〕表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、和等。DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能；质粒DNA分子上有，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是。考点二基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取（1）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指的基因。（2）筛选合适的目的基因①从相关的已知清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用和序列比对工具进行筛选。（3）获取目的基因的方法①人工合成目的基因a.逆转录法：已知目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以以目的基因的mRNA为模板，借助酶合成双链DNA。b.化学合成法：已知某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因。②获取和扩增目的基因③通过构建来获取目的基因。2.基因表达载体的构建——基因工程的核心（1）目的：使目的基因，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）基因表达载体的组成（3）构建过程提醒：区分启动子、终止子、起始密码子、终止密码子教材拾遗：〔选择性必修3P80“图3-6”〕不能将目的基因插入载体的标记基因中的原因是标记基因用于鉴定目的基因是否成功导入受体细胞，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若标记基因中有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进行筛选。3.将目的基因导入受体细胞（1）转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，从变异的角度分析都属于。（2）不同受体细胞导入方法不同（3）农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入提醒：（1）花粉管通道法受体细胞是受精卵，农杆菌转化法受体细胞是体细胞。（2）导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。前联后挂：（1）农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞，但基因工程最终要的是转基因植株，如何实现这一目标：得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养。（2）研究人员将两个抗虫基因（T）导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。两个抗虫基因在染色体上随机整合有如图所示情况，其自交后代表型及比例分别是多少？甲自交子代全为抗虫；乙自交子代抗虫∶不抗虫＝3∶1；丙自交子代抗虫∶不抗虫＝15∶1。4.目的基因的检测与鉴定（1）方法（2）检测转基因生物染色体上是否插入目的基因方法1：PCR等技术（图中M：marker；1：阳性质粒；2：原始品系；3～9：成功插入目的基因）方法2：DNA分子杂交技术①原理：DNA-DNA碱基互补配对。②基因探针：一般是指一小段单链DNA或RNA，能与目的基因的一条链碱基互补配对，并带有标记或荧光标记。③过程：出现，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。（3）检测目的基因是否转录方法1：PCR等技术提取培育出的转基因植株细胞中的RNA，依据目的基因两端的特异性序列设计两种引物，对转基因植物细胞中的DNA进行RT-PCR扩增。对扩增产物进行电泳鉴定。方法2：分子杂交技术①原理：DNA-RNA碱基互补配对。②过程：（4）检测目的基因是否翻译出蛋白质①方法：抗原—抗体杂交技术。②原理：。③过程：提取转基因植物的蛋白质（作为抗原）＋相应抗体→是否出现杂交带。前联后挂：胰岛素基因探针，既能与胰岛素基因的一条链形成杂交分子，也可与胰岛素基因转录形成的mRNA形成杂交分子。人体的细胞中，胰岛B细胞的DNA和mRNA能与胰岛素基因探针形成杂交分子，而其他细胞中只有DNA能与之形成杂交分子。1.将质粒DNA进行酶切时，发现DNA完全没有被酶切，原因是酶切条件不合适，可通过调整反应条件，如温度和酶的用量等。 （2024·湖南卷）（）2.启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因翻译。（2023·全国乙卷）（）3.构建基因表达载体是基因工程的核心工作。 〔选择性必修3P80正文〕（）4.Ti质粒上的T-DNA可携带目的基因进入宿主细胞，并可将目的基因整合到该细胞的染色体DNA中。 〔选择性必修3P81资料卡〕（）构建基因表达载体的过程分为酶切和连接两个步骤。下图为构建基因表达载体时所用的载体及目的基因所在DNA片段上限制酶的识别切割位点情况。（1）选择SpeⅠ进行单酶切构建基因表达载体时，容易出现目的基因和载体的自身环化，以及目的基因的反向连接，导致目的基因转录时出现错误，无法表达正常的蛋白质。（2）选择BamHⅠ与BglⅡ进行双酶切构建基因表达载体时，能否避免单酶切时出现的目的基因和载体的自身环化，以及目的基因的反向连接？为什么？（3）选择BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切构建基因表达载体时，能否避免单酶切时出现的目的基因和载体的自身环化，以及目的基因的反向连接？为什么？1.正向连接与反向连接的检测（1）电泳检测使用两种不同的限制酶对重组质粒进行切割，根据理论分析得到酶切产物的大小并进行琼脂糖凝胶电泳分析。如果目的基因插入方向正确，将出现预期的酶切产物大小。如果目的基因插入方向不正确，电泳后将出现另外一组大小不同的产物。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示）：问题探讨：经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第②泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。（2）利用PCR进行检测方法：用特定的引物对正向连接和反向连接的重组质粒进行PCR扩增。2.影印法筛选含有目的基因的受体细胞（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，破坏某一抗生素抗性基因，保留另外一个抗性基因。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。（2）被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。（3）筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。考查基因工程的基本流程1.（2025·安徽高考15题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（）A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数B.如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株C.因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌2.（2025·四川高考19题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA－lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5'-3'方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。（1）用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA－lrcF目的基因时，应选用引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是。（2）采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是。（3）由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致，最终引起细菌死亡。（4）重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有（答出1点即可）。考点三DNA的粗提取和DNA片段的扩增与电泳鉴定1.DNA的粗提取与鉴定（1）基本原理（2）实验步骤2.DNA片段的扩增与电泳鉴定（1）实验基础（2）利用PCR（聚合酶链式反应）技术扩增DNA片段教材拾遗：〔选择性必修3P77“相关信息”〕真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（3）PCR实验的操作步骤提醒：（1）在PCR过程中实际加入的原料为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。（2）复性温度过高，则引物难以与模板链结合；温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。（3）在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操作：为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理；在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染；在进行操作时，一定要戴好一次性手套。（4）DNA的电泳鉴定提醒：（1）DNA分子在缓冲液中带负电荷，点样时点在负极使DNA向正极移动。（2）DNA分子的相对分子量越大，电泳时的迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，电泳时迁移速率越快。1.DNA的粗提取与鉴定用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”。 （2025·湖南卷）（）2.在提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后观察颜色以鉴定DNA。 （2025·河北卷）（）3.配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。 （2024·河北卷）（）4.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。 （2024·河北卷）（）5.PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。（2022·辽宁卷）（）6.粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。 （2022·山东卷）（）7.动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。 （2022·湖北卷）（）根据PCR反应过程示意图分析下列问题：（1）PCR技术为什么需要引物？（2）利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？（3）为扩增目的基因，应选择下图所示引物中的。（4）某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如图），请分别说明理由。①第1组：；②第2组：。（5）为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？（6）若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？PCR引物的设计、修饰和计算（1）PCR引物的设计原则①引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23bp。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模板链随机结合。②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构，这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3'端的互补重叠以防形成引物二聚体。（2）引物与复性温度①复性温度：复性温度偏高，引物不能与模板很好地复性，扩增特异性强，扩增效率低；复性温度偏低，引物将产生非特异复性，导致非特异性的DNA片段的扩增，扩增效率高。②引物：ⅰ.引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度；ⅱ.引物GC含量越高，变性温度也越高。（3）引物的修饰①引物3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。②引物5'端可以修饰。引物5'端常见修饰包括：添加酶切位点；引入启动子序列、插入突变序列等。（4）PCR扩增过程中的循环图示与规律循环次数123nDNA分子数2482n含引物A（或B）的DNA分子数1372n－1同时含引物A、B的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗的引物数量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－22n＋1－2考查DNA的粗提取与鉴定1.（2024·安徽高考14题）下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（）A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质2.（2023·福建高考4题）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验Ⅰ）和“DNA的粗提取与鉴定”（实验Ⅱ）的实验操作，下列相关叙述正确的是（）A.实验Ⅰ中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理B.实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源C.实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNAD.实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA考查DNA片段的扩增与电泳鉴定3.（2025·全国卷6题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（）A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物4.（2025·全国卷11题）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1～4结合位置如图所示，→表示引物5'→3'方向）。回答下列问题：（1）PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是，而PCR过程中解开双链的方法是。（2）PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有。（3）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：；②无扩增产物，原因是；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是。管号①②③④⑤⑥模板无P0Px无P0Px引物对引物1和引物2引物3和引物4（4）设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果。一、命题角度练角度一以基因工程的基本工具为核心，考查生命观念、科学思维1.（2024·湖南高考5题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（）A.限制酶失活，更换新的限制酶B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNAD.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶角度二以基因工