细胞工程动物细胞培养工程说课稿

细胞工程CellEngineeringChapter4、动物细胞培养工程

4．1概述4．2生产用动物细胞系4．3培养液和培养环境4．4动物细胞培养工艺4．5动物细胞培养过程的放大与优化4．6动物细胞代谢工程4．7动物细胞工程产品制备及质控4．8动物细胞工程体现产品的应用4．1概述

4．1．1定义：动物细胞培养工程：是指以工业化为目的，应用动物细胞培养的基本原理，硕士物活细胞为主体的生物反映过程，解决动物细胞培养过程中带有共性和特性的工程技术问题的一门应用性科学技术。它依靠三部分技术，细胞培养技术（基础）、生化工程技术（过渡）和生物反映器设计（生产技术）。它是大规模生产基因工程药品，单抗和疫苗等生物工程产品的核心技术。4．1．2发展历程：

4．1．3动物细胞培养的特点与办法：A、动物细胞培养的重要特点动物细胞对营养规定高——血清来源受限，质量不稳，研发无血清培养液；动物细胞对培养环境适应性差——生长慢，时间长，生长用动物细胞需驯化；动物细胞培养对环境条件规定严格——pH，混合气体（O2、CO2、N2）；动物细胞培养过程易产生污染——规定苛刻；多个细胞长久培养易变异——需监测其形态、生长、体现过程；绝大多数的哺乳类动物细胞具贴壁依赖性生长特性——需载体。

附、植物细胞特性与细胞培养与微生物比较，植物细胞大；悬浮培养时，植物细胞易结团，2mm，浓度高、粘度大，分泌粘多糖（硅油减少粘度），产生泡沫，需消泡；细胞有壁，易受剪切力高的装置损伤；与微生物细胞相比，生长慢，周期长，分批2-3周，半连续与持续2-3周；与微生物细胞比较，需光、好气，CO2/O2比要控制；单细胞3-5天分裂，1周小细胞团成愈伤组织，可转移至分化培养基上；植物悬浮细胞生长与增殖可分为：延迟、对数生长、直线生长、减缓、静止、衰亡期；B、动物细胞培养工程的办法

悬浮培养：螺旋桨或平桨搅拌通用发酵罐——适应淋巴细胞、骨髓瘤细胞等方法单层培养——滚瓶法：间歇接触培养液和空气

固定化培养微珠微载体培养比表面积大中空纤维

4．1．4动物细胞培养工程技术现状与展望

A、70%生物技术产品使用动物细胞生产；B、生产技术、工艺条件变化明显：

培养方式：从固着贴壁式变为悬浮式、从间歇式变为悬浮持续式；培养介质：用动物血清变为无血清无蛋白培养液；生物反映器控制：从黑箱式到计算机到人工智能。

C、中国与美国动物细胞工程技术比较（见表）

中国，实验室规模

流加工艺：产量高易放大、操作简朴，美国，产业如Genentech、IDEC、化规模生产MedImmune、Merk公司，蛋白质公司持续灌注工艺：适合不稳定产品、培养运用低、操作复杂、产品回收大，如：Genzyme、GeneticInstitute、Bayer公司

中国美国批式培养（batch）2-100L中试规模产业化手段；12000L工业反应器流加培养（fedbatch）5-500L中试规模产业化手段；12000L工业反应器灌注培养（perfusion）5-30L中试规模产业化手段；12000L工业反应器D、动物细胞培养工程技术是当今生物制药领域最重要的核心技术之一；（10000L规模、g/L级）E、大规模动物细胞培养生产中还存在问题需要解决：去除培养环境中外源因子的污染在线检测与工艺控制，如O2限定与溶解CO2尝试累积的控制新细胞生物反映器系统的开发运用4．2生产用动物细胞系4．2．1生产用动物细胞发展：生产用动物细胞——是指按生产条件选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍体细胞、持续细胞系、融合细胞和重组细胞的历史演化。4．2．2生产用动物细胞的来源4．2．3惯用生产用动物细胞的特性（参见下表）4．2．4生产用动物细胞库生产用动物细胞库:是指为确保生产用动物细胞有稳定和高水平的质量和生物安全性，能够长久、稳定地生产出符合规定的高质量生物制品的储蓄系统。现在，已经制订有三级细胞库系统对应保存管理方法（档案和技术原则）。bu4．2．5生产用动物细胞代谢工程优化改造

A、因素：与原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞相比，动物细胞体现的外源蛋白质最靠近天然构想，是生物本身的生长代谢特性并非最佳，为提高培养细胞活性和单位细胞的产率，延长培养周期，必须采用代谢工程办法优化改选宿主细胞，对细胞本身的遗传特性进行功利性修饰。B、代谢工程（metabolicengineering）：是通过DNA重组技术和分子生物学手段变化酶系功效或物质转动功效，以改进细胞某些方面的代谢活性，进行精确目的的遗传操作。C、具体优化改选方法：●构建在无血清、无蛋白条件下增殖的细胞株，实现无血清无蛋白培养；（血清是基本添加物，但含未拟定成分，如有毒的多胺氧化酶，成本高，来源少，易污染）●敲除或引入动物细胞的乳酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶，减少代谢产物乳酸和氨的产生，以变化细胞能量代谢途径；●引入粘附因子纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原或玻璃粘连蛋白，增进细胞贴壁性；●构建抗细胞凋亡工程细胞系，增强细胞对恶劣培养条件的抵抗力。（参见下图）●将细胞周期蛋白激酶（CDK）克制蛋白基因p21和p27引入细胞，获得细胞周期增殖控制的表型，通过调控细胞增殖周期达成调控细胞增殖目的；（参见下图）●导入外源性糖基转移酶基因，变化细胞的糖链合成能力，改善重组蛋白糖基化修饰。4．3

培养液与培养环境

4．3．1动物细胞培养条件

4．3．2动物细胞培养液和添加剂

4．3．3无血清无蛋白培养优点：化学组分明确，批次间重复性好，易检测，适合