SARS-CoV-2假病毒：构建技术特性分析及多元应用探索

SARS・CoV-2假病毒：构建技术、特性

分析及多元应用探索

一、引言

1.1研究背景与意义

自2019年底新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情爆发以来，严重威胁着全球公共卫生安全

和经济社会发展。其病原体SARS-CoV-2是一种具有囊膜、基因组为线性单链正链的RNA

病毒、主要通过呼吸道飞沫和密切接触传播，人群普遍易感。感染后，大多数患者会出现发

热、干咳、乏力等症状，部分患者病情进展迅速，可发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休

克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等，严重时危及生命。据世界卫生组织

（WHO）统计，截至［具体时间］,全球累计确诊病例已达［X］例，累计死亡病例超过［X］例，

给人类健康和社会经济带来了巨大的冲击。

由于SARS-CoV-2具有高传染性和致病性，对活病毒的研究需要在生物安全三级（BSL-3）

及以上实验室进行，这不仅对实验条件要求苛刻，操作过程中还存在较大的安全隐患，极大地

限制了相关研究的开展速度和范围。SARS-CoV-2假病毒作为一种安全有效的研究工具应运

而生，为解决这些问题提供了新的途径。

SARS-CoV-2假病毒是通过基因工程技术，将SARS-CoV-2的关键基因（如刺突蛋白S基

因）整合到其他病毒载体（如慢病毒载体）中构建而成。它虽然不含有SARS-CoV-2的完整

基因组，不具备复制和致病能力，但却能够模拟真病毒的感染过程，具有与真病毒相似的表面

结构和感染特性。在病毒学研究领域，SARS-CoV-2假病毒可用于研究病毒的感染机制，包

括病毒与宿主细胞受体（如血管紧张素转化酶2,ACE2）的相互作用、病毒进入细胞的途径

和过程等。通过对假病毒感染过程的研究，有助于深入了解SARS-CoV-2的致病机制，为开

发针对性的治疗方法和药物提供理论基础。

在疫苗研发方面，SARS-CoV-2假病毒发挥着重要作用。它可以作为替代模型，用于评估疫

苗的有效性和安全性。传统的疫苗有效性评价需要使用活病毒进行中和试验，操作风险高且难

度大。而利用假病毒进行中和试验，不仅能够在生物安全二级（BSL-2）实验室中安全进行，

还能快速、准确地检测疫苗诱导的中和抗体水平，为疫苗的研发和优化提供关键数据支持。

例如，在新冠疫苗的研发过程中，科研人员利用SARS-CoV-2假病毒对不同疫苗候选物进行

中和活性检测，筛选出具有良好免疫原性和保护效果的疫苗，加速了疫苗的研发进程。

在抗病毒药物研发中，SARS-CoV-2假病毒同样具有重要价值。它可以用于高通量筛选抗病

毒药物，快速评估药物对病毒感染的抑制作用。通过将假病毒与不同的药物进行孵育.然后

检测其对宿主细胞的感染能力，能够筛选出具有潜在抗病毒活性的药物，为后续的药物研发和

临床试验提供重要参考。此外，假病毒还可用于研究药物的作用机制，明确药物是如何阻断病

毒感染过程的，有助于优化药物设计，提高药物疗效。

SARS-CoV-2假病毒在病毒检测试剂的研发和质量控制中也发挥着不可或缺的作用。它可以

作为阳性对照品，用于评估病毒核酸检测试剂盒和抗体检测试剂盒的性能，确保检测试剂的准

确性和可靠性。在临床诊断中，使用假病毒对检测试剂进行验证，能够提高检测结果的可信

度.为疫情防控提供有力的技术支持。

SARS-CoV-2假病毒的构建及其应用研究对于深入了解SARS-CoV-2的生物学特性、加速疫

苗和抗病毒药物的研发、提高病毒检测的准确性以及有效防控C0VID-19疫情具有重要的理

论意义和实际应用价值。

1.2国内外研究现状

在SARS-CoV-2假病毒构建方面，国内外学者已取得了一系列重要成果。早期，国外研究团

队率先利用慢病毒载体系统，将SARS-CoV-2的刺突蛋白(S蛋白)基因整合到慢病毒基因

组中，成功构建出具有感染活性的假病毒。例如，【具体国外团队名称］通过优化转染条件和病

毒包装过程，获得了高滴度的假病毒，为后续研究奠定了基础。他们的研究表明，这种假病毒

能够特异性地感染表达血管紧张素转化酶2(ACE2)的细胞，且感染效率与野生型病毒相

当。国内科研团队也迅速跟进，在假病毒构建技术上不断创新°［国内团队1］通过对S蛋白

基因进行密码子优化，提高了其在宿主细胞中的表达水平，进而增强了假病毒的感染能力。同

时，［国内团队2］采用了新型的病毒包装细胞系，简化了假病毒的制备流程，降低了生产成

本，使得假病毒能够更广泛地应用于科研和临床检测中。

在SARS-CoV-2假病毒的应用研究方面，国内外均取得了显著进展。在疫苗研发领域，假病

毒被广泛用于评估疫苗的免疫原性和中和抗体水平。国外多个疫苗研发项目利用假病毒中和试

验，快速筛选出具有良好免疫效果的疫苗候选株，并在临床试验中取得了成功。例如，［某国

外知名疫苗研发项目］通过假病毒中和试验，证明了其研发的mRNA疫苗能够诱导机体产生

高水平的中和抗体，有效预防SARS-CoV-2的感染。国内的疫苗研发团队同样借助假病毒技

术，对多种类型的新冠疫苗进行了有效性验证。［国内某疫苗研发项目］利用假病毒检测了灭活

疫苗接种者血清中的中和抗体水平，结果显示该疫苗能够激发强烈的免疫反应，为疫苗的大规

模生产和应用提供了有力支持。

在抗病毒药物研发方面，SARS-CoV-2假病毒也发挥了重要作用。国内外研究人员利用假病

毒建立了高通量药物筛选模型，对大量化合物进行了抗病毒活性筛选。［国外研究小组］通过该

模型筛选出了几种具有潜在抗病毒活性的小分子化合物，并进一步研究了它们的作用机制。国

内的科研人员则利用假病毒，对一些传统中药和天然产物进行了抗病毒研究，发现了一些具有

良好抗病毒效果的成分，为开发新型抗病毒药物提供了新思路C

在病毒检测试剂的研发和质量控制中，SARS-CoV-2假病毒作为阳性对照品，为确保检测试

剂的准确性和可靠性发挥了关键作用。国内外众多诊断试剂生产企业在产品研发和质量检测过

程中，均采用假病毒对核酸检测试剂盒和抗体检测试剂盒进行性能险证。I某国外诊断试剂企

业］利用假病毒对其研发的核酸检测试剂盒进行了灵敏度和特异性测试，结果表明该试剂盒能

够准确检测出低浓度的病毒核酸。国内的［某知名诊断试剂企业］同样利用假病毒对抗体检测

试剂盒进行了评估，确保了试剂盒的检测性能符合临床需求。

当前SARS-CoV-2假病毒的研究也存在一些不足之处。一方面.不同实验室构建的假病毒在

质量和性能上存在一定差异，缺乏统一的标准和规范，这给研究结果的可比性和重复性带来了

挑战。另一方面，随着SARS-CoV-2的不断变异，现有的假病毒可能无法完全模拟新变异株

的特性，需要进一步开发针对不同变异株的假病毒。此外，假病毒在长期储存和运输过程中的

稳定性问题也有待进一步解决，以确保其在实际应用中的有效性。

1.3研究目标与内容

本研究旨在构建高滴度、稳定性好且具有感染活性的SARS-CoV-2假病毒，并深入分析其在

病毒学研究、疫苗研发、抗病毒药物筛选以及病毒检测试剂评价等多个领域的应用，为

C0VID-19的防控和相关研究提供有力的技术支持和实验依据。

本研究将通过基因工程技术，对SARS-CoV-2的关键基因进行克隆和表达，将其整合到合适

的病毒载体（如慢病毒载体）中，构建SARS-CoV-2假病毒。在构建过程中，优化转染条

件、病毒包装细胞系以及病毒纯化方法，以获得高滴度和高纯度的假病毒。对构建成功的

SARS-CoV-2假病毒，分析其生物学特性，包括病毒的感染活性、宿主细胞特异性、刺突蛋

白的表达和功能等。通过细胞实验和动物实验，研究假病毒与宿主细胞受体的相互作用机制，

以及假病毒在体内外的感染过程和免疫原性。利用构建的SARS-CoV-2假病毒,建立基于假

病毒的中和试验方法，用于评估疫苗的免疫效果和筛选抗病毒药物。在疫苗研发方面，将假病

毒应用于不同类型疫苗（如灭活疫苗、mRNA疫苗、重组蛋白疫苗等）的免疫原性评价，检

测疫苗诱导的中和抗体水平，为疫苗的优化和改进提供数据支持。在抗病毒药物筛选中，通

过高通量筛选技术，利用假病毒对大量化合物进行抗病毒活性筛选，发现具有潜在抗病毒作用

的约物，井进一步研究其作用机制。以SARS-CoV-2假病毒为阳性对照品，对病毒核酸检测

试剂盒和抗体检测试剂盒进行性能评估，包括灵敏度、特异性、重复性等指标的测定，确保检

测试剂能够准确、可靠地检测出病毒或抗体。通过分析假病毒在检测试剂评价中的应用效

果，提出改进检测试剂性能的建议和方法，提高病毒检测的准确性和效率。

二、SARS・CoV-2假病毒构建的理论基础

2.1假病毒的概念与原理

假病毒是一种通过基因工程技术构建而成的特殊病毒形式，它将一种病毒的关键基因（如包膜

糖蛋白基因）整合到另一种病毒载体（通常是反转录病毒载体，如慢病毒载体）中。其基本

原理是利用载体病毒的基因组和包装系统，表达外源性病毒的特定蛋白，从而形成具有外源性

病毒表面特征，但基因组仍保持载体病毒特性的病毒样颗粒。在SARS-CoV-2假病毒的构建

中，通常将SARS-CoV-2的刺突蛋白（S蛋白）基因整合到慢病毒载体中。S蛋白是SARS-

C0V-2感染宿主细胞的关键蛋白，它由S1和S2两个业基组成，其中S1业基负责与宿主细

胞表面的受体血管紧张素转化酶2（ACE2）结合，S2亚基则介导病毒包膜与宿主细胞膜的融

合，从而使病毒进入宿主细胞。通过将S蛋白基因整合到慢病毒载体中，慢病毒在包装细胞

内进行转录和翻译，表达出S蛋白并组装到病毒颗粒表面，形成具有SARS-CoV-2感染特性

的假病毒。这种假病毒能够模拟真病毒与宿主细胞受体的结合和感染过程，但由于其基因组

中缺乏SARS-CoV-2的完整复制序列，不具备自主复制和致病能力。

假病毒与真病毒在结构和功能上存在明显差异。真病毒具有完整的基因组，能够在宿主细胞

内进行自主复制和传播，导致宿主细胞病变和机体发病。而假病毒虽然具有与真病毒相似的

表面结构，能够与宿主细胞受体结合并进入细胞，但由于其基因组的限制，只能进行单轮感

染，不会在细胞内大量复制和产生子代病毒。假病毒的基因组通常是经过改造的载体病毒基

因组，仅携带了用于表达外源性病毒蛋白的基因片段，以及必要的调控元件和报告基因等。

这些报告基因（如荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等）可以方便地用于检测假病毒的感染效

率和病毒滴度。

假病毒在研究中具有诸多优势。由于假病毒不具备复制和致病能力，操作安全性高，可在生

物安全二级（BSL-2）实验室进行研究，大大降低了实验风险，拓宽了研究的范围和条件。

假病毒的制备相对简单，通过基因工程技术可以快速构建和大量生产，且其质量和性能易于控

制和标准化。在疫苗研发中，假病毒可用于快速评估疫苗的免疫原性和中和抗体水平，为疫

苗的筛选和优化提供关键数据。在抗病毒药物研发中，假病毒能够作为高通量筛选的工具，

快速评估药物对病毒感染的抑制作用，加速药物研发进程。

2.2SARS-CoV-2的结构与感染机制

SARS-CoV-2作为一种有包膜的单链RNA病毒，其结构复杂且独特，这与其感染机制紧密相

关。病毒表面有呈棍棒状突起的刺突蛋白（S蛋白），这是其感染宿主细胞的关键结构。S

蛋白由S1和S2两个亚基组成，S1亚基负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转化酶2

（ACE2）结合，其中S1亚基的C端受体结合域（RBD结构域）是与ACE2相互作用的关

键位点。S2亚基则介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合，使病毒能够进入宿主细胞。

除S蛋白外，SARS-CoV-2基因组还编码包膜蛋白（E蛋白）、基质蛋白（M蛋白）以及核

衣壳蛋白（N蛋白）。E蛋白在病毒组装和释放过程中发挥作用，参与维持病毒包膜的稳定

性；M蛋白则对病毒的形态和结构完整性至关重要，协助病毒粒子的组装；N蛋白主要与病

毒基因组RNA结合，形成核衣壳结构，保护病毒RNA并参与病毒的复制和转录过程。

SARS-CoV-2的感染过程是一个多步骤的复杂过程。病毒通过呼吸道飞沫或密切接触传播，

当病毒颗粒接触到宿主细胞表面时，S蛋白的S1亚基首先与ACE2受体特异性结合。研究

表明，SARS-CoV-2的RBD结构域与ACE2的结合亲和力较高，这种高亲和力使得病毒能够

有效地吸附在宿主细胞表面。结合后，S蛋白在宿主细胞蛋白酶（如弗林蛋白酶等）的作用

下，在S1/S2位点发生切割，将S蛋白裂解为S1和S2亚基。随后，S2亚基进一步发生构

象变化，暴露出七肽重复序列1（HR1）和七肽重复序列2（HR2）。HR1和HR2相互作用

形成一个稳定的六螺旋束结构，拉近病毒包膜与宿主细胞膜的距离，从而促进病毒包膜与宿主

细胞膜的融合。病毒基因组RNA随之进入宿主细胞内，开始进行复制和转录过程。病毒

RNA首先翻译出多聚蛋白前体pplab和ppla,它们在病毒蛋白酶的作用下被切割成多个非

结构蛋白，参与病毒的复制和转录调控。接着，病毒以自身RNA为模板，合成负链RNA中

间体，再以负链RNA为模板合成大量的正链RNA,这些正链RNA一部分作为子代病毒的基

因组，另一部分则用于翻译病毒的结构蛋白和辅助蛋白。在宿主细胞的内质网和高尔基体

中，病毒的结构蛋白与基因组RNA组装成新的病毒粒子，通过囊泡运输的方式释放到细胞

外，继续感染其他细胞。

2.3构建SARS-CoV-2假病毒的关键技术

构建SARS-CoV-2假病毒涉及多种关键技术，这些技术的协同应用是获得高质量假病毒的关

键。

慢病毒载体系统是构建SARS-CoV-2假病毒的常用工具。慢病毒属于逆转录病毒科，其基因

组为单链RNA。在构建假病毒时，慢病毒载体通常携带报告基因（如荧光素酶基因、绿色荧

光蛋白基因等），便于后续对假病毒感染效率和病毒滴度的检测。以荧光素酶报告基因的慢

病毒载体为例，将SARS-CoV-2的刺突蛋白（S蛋白）基因插入慢病毒载体中，与载体上的

其他元件（如启动子、增强子等）共同组成重组载体。在包装细胞（如293T细胞）中，重

组载体与其他辅助质粒（如包装质粒、包膜质粒等）共转染，利用包装细胞内的转录和翻译系

统，表达出S蛋白、慢病毒的结构蛋白以及其他辅助蛋白，这些蛋白在细胞内组装成假病毒

颗粒。慢病毒载体系统具有感染宿主范围广、能够整合到宿主细胞基因组中实现稳定表达等

优点。它不仅可以感染分裂细胞，还能感染非分裂细胞，如神经元细胞、心肌细胞等，这使

得假病毒能够模拟SARS-CoV-2在多种类型细胞中的感染过程.为研究病毒的细胞嗜性和组

织嗜性提供了便利。慢病毒载体的整合特性有助于长期观察假病毒在细胞内的行为和对细胞

生理功能的影响。

细胞转染技术是将重组质粒导入包装细胞的关键步骤。常用的细胞转染方法包括化学转染法

（如脂质体转染法、磷酸钙转染法）和物埋转染法（如电穿孔法、显微注射法）。脂质体转

染法是利用阳离子脂质体与带负电荷的质粒DNA形成复合物，通过细胞的内吞作用进入细

胞。这种方法操作简单、转染效率较高，且对细胞毒性较小，是构建SARS-CoV-2假病毒常

用的转染方法。在使用脂质体转染法时，需要优化脂质体与质粒DNA的比例、转染时间和细

胞密度等条件，以提高转染效率。研究表明，当脂质体与质粒DNA的比例为［X］时，在细胞

密度为［X］的条件下转染［X］小时，可获得较高的转染效率，从而提高假病毒的产量。电穿孔

法是通过电场作用在细胞膜上形成小孔，使质粒DNA进入细胞。该方法转染效率高，但对细

胞的损伤较大，需要精确控制电场强度、脉冲时间等参数，以平衡转染效率和细胞存活率。

不同的细胞系对转染方法的敏感性不同.因此在构建假病毒时,需要根据包装细胞的特性选择

合适的转染方法和条件。

基因编辑技术在SARS-CoV-2假病毒构建中也发挥着重要作用。通过基因编辑技术，可以对

SARS-CoV-2的基因进行精确修饰，如突变、敲除或插入特定的基因片段，以研究基因功能

和病毒变异对感染特性的影响。CRISPR/Cas9系统是一种常用的基因编辑工具，它由Cas9

核酸酶和向导HNA(gHNA)组成。gHNAoj以引导Cas9核酸酶识别并切割特定的DNA序

列，然后通过细胞的同源重组或非同源末端连接修复机制，实现对基因的编辑。在构建

SARS-CoV-2假病毒时，可以利用CRISPR/Cas9系统对S蛋白基因进行定点突变，模拟病

毒的自然变异，研究突变后的S蛋白与宿主细胞受体ACE2的结合能力、病毒的感染效率以

及免疫逃逸机制等。研究人员通过CRISPR心as9技术对S蛋3的受体结合域(RBD)进行

突变，发现某些突变可以增强S蛋白与ACE2的结合亲和力，从而提高假病毒的感染能力，

这为深入了解SARS-CoV-2的进化和传播机制提供了重要线索。

三、SARS・CoV-2假病毒的构建方法与优化

3.1实验材料与准备

细胞系是构建SARS-CoV-2假病毒的基础材料，本研究选用人胚肾细胞293T细胞系作为病

毒包装细胞。293T细胞具有易于转染、生长迅速、表达外源蛋白能力强等优点，是构建假病

毒常用的细胞系。在实验前，需将293T细胞复苏并培养于含有10%胎牛血清(FBS)、

1%青霉素-链霉素双抗的高糖DMEM培养基中，置于37℃.5%C02的细胞培养箱中培

养,定期更换培养基，待细胞生长至对数期时用于后续实验。为确保细胞状态良好，需定期

对细胞进行支原体检测、防止支原体污染影响实验结果。研究表明，支原体污染会干扰细胞

的代谢和基因表达，降低转染效率，进而影响假病毒的产量和质量。可采用PCR法或支原体

检测试剂盒对细胞进行检测，若发现支原体污染，应及时丢弃污染细胞，重新复苏无污染的细

胞进行培养。

质粒是构建假病毒的关键元件，主要包括慢病毒骨架质粒、包装质粒和携带SARS-CoV-2刺

突蛋白(S蛋白)基因的表达质粒。慢病毒骨架质粒如pLVX系列，其携带报告基因(如荧

光素酶基因Luciferase或绿色荧光蛋白基因eGFP),便于后续对假病毒感染效率和病毒滴

度的检测。包装质粒(如psPAX2)可提供病毒包装所需的各种蛋白，包括gag、poLrev

等，这些蛋白参与病毒颗粒的组装和稗放过程。携带SARS-CoV-2s蛋白基因的表达质粒是

假病毒构建的核心，需通过基因克隆技术将S蛋白基因插入合适的表达载体中。在质粒准备

过程中，需使用无内毒素质粒提取试剂盒对质粒进行提取和纯化，以去除内毒素等杂质，提高

质粒的纯度和质量。内毒素会对细胞产生毒性，影响细胞的生长和转染效率，进而影响假病

毒的构建。采用分光光度计或核酸浓度测定仪对提取的质粒进行浓度和纯度测定，要求质粒

的OD26o/0D28o比值在1.8-2.0之间，以确保质粒的质量符合实验要求。

实验所需试剂众多，包括转染试剂、细胞培养试剂、病毒浓缩和纯化试剂等。转染试剂是将

质粒导入293T细胞的关键，常用的转染试剂有脂质体转染试剂(50Lipofectamine3000)和

聚乙烯亚胺(PEI)等。在选择转染试剂时，需考虑其转染效率、细胞毒性以及成本等因

素。研究表明，Lipofectamine3000具有较高的转染效率和较低的细胞毒性，是构建SARS-

CoV-2假病毒常用的转染试剂。细胞培养试剂如高糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、青

毒素-链霉素双抗等，需选用优质产品，并严格按照说明书进行储存和使用。病毒浓缩和纯

化试剂如超速离心管、蔗糖、聚乙二醇(PEG)等，用于假病毒的浓缩和纯化，以提高假病

毒的滴度和纯度。在使用前，需对所有试剂进行质量检查，确保其尢微生物污染和变质，对

于一些易变质的试剂，如FBS,应在规定的时间内使用，避免因试剂质量问题影响实验结

果O

3.2构建流程与操作步骤

慢病毒载体改造是构建SARS-CoV-2假病毒的关键起始步骤。将含有SARS-CoV-2刺突蛋

白（S蛋白）基因的表达质粒通过限制性内切酶酶切和连接反应，插入慢病毒骨架质粒中。

例如，选用合适的限制性内切酶（如EcoRI和BamHI）对表达质粒和慢病毒骨架质粒进行

双酶切，以确保S蛋白基因能够准确地插入到慢病毒骨架质粒的特定位置。酶切反应体系通

常包含质粒DNA、限制性内切甑、相应的缓冲液和去离子水，在适宜的温度（如37℃）下孵

育一段时间（如2-4小时），使酶切反应充分进行。酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳对酶

切产物进行分离和鉴定.切取含有目的基因片段的凝胶条带，利用凝胶回收试剂盒回收目的基

因片段和线性化的慢病毒骨架质粒o将回收的S蛋白基因片段与线性化的慢病毒骨架质粒在

DNA连接酶的作用下进行连接反应。连接反应体系包括目的基因片段、线性化慢病毒骨架质

粒、T4DNA连接酶、连接缓冲液等，在16℃条件下孵育过夜，使目的基因与慢病毒骨架质

粒连接成重组慢病毒载体。连接产物可通过转化大肠杆菌感受态细胞进行扩增。将连接产物

加入到大肠杆菌感受态细胞中，冰浴一段时间后，进行热激处理（如42℃,90秒），然后迅

速放回冰浴，使连接产物进入大肠杆菌细胞内。将转化后的大场杆菌涂布在含有相应抗生素

（如氨羊青霉素）的LB固体培养基平板上，37。（：培养过夜，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定

和测序验证，确保重组慢病毒载体构建正确。

质粒转染细胞是假病毒包装的重要环节。当293T细胞生长至对数期，细胞密度达到约80%-

90%时，进行转染操作。转染前，需更换为无血清无双抗的高糖DMEM培养基，以减少血

清和抗生素对转染效率的影响。按照转染试剂Lipofectamine3000）说明书，将重组慢

病毒载体与包装质粒（如psPAX2）、包膜质粒（如pMD2.G）以一定比例（通常为4:3:1）

混合，加入适量的Opti-MEM培养基稀释，轻轻混匀。将稀释后的质粒混合液与预先稀释好

的转染试剂混合，室温孵育15・20分钟，使转染试剂与质粒形成复合物。将复合物逐滴加入

到293T细胞培养皿中，轻轻摇匀，放回37。（2、5%CO2的细胞培养箱中培养。在转染后4-

6小时，更换为含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，继续培养。研究表明，在转染后

24小时和48小时分别观察细胞状态和荧光表达情况（若重组慢病毒载体携带荧光报告基

因），可评估转染效率。若转染效率较低，可调整转染试剂与质粒的比例、转染时间或细胞

密度等条件，进行优化。

假病毒收集与纯化是获得高质量假病毒的关键步骤。在转染后48-72小时，收集含有假病毒

的细胞培养卜清“将细胞培养卜清转移至离心管中.4℃、3000rpm离心10・15分钟.夫除

细胞碎片和杂质。可采用超速离心法对假病毒进行浓缩和纯化。将离心后的上清转移至超速

离心管中,在超离心机中,4。（2、100000-120000*9离心2-3小时，使假病毒沉淀在离心

管底部。小心弃去上清，用适量的PBS缓冲液重悬假病毒沉淀，4。（：保存备用。也可使用超

滤浓缩管对假病毒进行浓缩，将细胞培养上清加入超滤浓缩管中，按照说明书进行离心操作，

便假病毒浓缩在超滤浓缩管的底部，然后用PBS缓冲液将浓缩后的假病毒洗脱|、来。为了进

一步提高假病毒的纯度，可采用蔗糖密度梯度离心法。制备不同浓度（如20%、30%、

40%）的蔗糖溶液，按照浓度从高到低的顺序依次将蔗糖溶液加入超速离心管中，形成蔗糖密

度梯度。将浓缩后的假病毒溶液小心地铺在蔗糖密度梯度的上层，4℃,100000-120000xg

离心2-3小时。假病毒会在蔗糖密度梯度中形成一条清晰的条带，用注射器小心地将假病毒

条带吸出，用PBS缓冲液稀释后，4。（2保存。通过这些方法获得的假病毒可用于后续的实验

研究。

3.3影响假病毒滴度与质量的因素分析

在构建SARS-CoV-2假病毒的过程中，质粒配比是影响假病毒滴度和质量的关键因素之一。

慢病毒载体构建中、重组慢病毒载体、包装质粒和包膜质粒的比例对假病毒的包装效率和感染

活性有显著影响。研究表明，当重组慢病毒载体（如pLVX系列携带SARS-CoV-2刺突蛋白

基因）、包装质粒（如PSPAX2）和包膜质粒（如pMD2.G）的质量比为4:3:1时，可获得较

高滴度的假病毒。这是因为在该比例下，病毒包装所需的各种蛋白（如gag、pol、rev等）

能够与重组慢病毒载体上的基因片段有效组装，形成完整且具有感染活性的假病毒颗粒。若

质粒配比不当，如包装质粒或包膜质粒不足，会导致病毒包装过程受阻，无法形成完整的假病

毒颗粒，从而降低假病毒滴度。当包装质粒与重组慢病毒载体的比例过低时，病毒的核心蛋

白（如gag蛋白）合成不足，无法有效包裹病毒基因组，使得假病毒的感染能力下降。不同

类型的质粒对假病毒质量也有影响。一些经过优化的质粒，其启动子和增强子元件能够更有

效地调控基因表达,从而提高刺突蛋白的表达水平，增强假病毒的感染活性。

转染试剂的选择和使用对假病毒滴度和质量同样至关重要。常用的转染试剂包括脂质体转染

试剂（$nLipofectamine3000）和聚乙烯亚胺（PEI）等,它们的转染效率和细胞毒性存在差

异。Lipofectamine3000具有较高的转染效率和较低的细胞毒性，能够有效地将质粒导入

293T细胞中.促进假病毒的包装。在使用Lipofectamine3000时，需严格按照说明书进行

操作，优化转染试剂与质粒的比例。研究发现，当Lipofectamine3000与质粒的比例为[X]

时，转染效率最高，假病毒滴度也相应提高o若转染试剂与质粒的比例过高，会导致细胞毒

性增加，细胞生长受到抑制，影响假病毒的产量。而PEI虽然成本较低.但转染效率相对较

低，且细胞毒性较大，可能会对细胞造成损伤，影响假病毒的质量。在使用PEI时，需要对

其浓度和作用时间进行精细优化，以平衡转染效率和细胞毒性c不同细胞系对转染试剂的敏

感性也不同，因此在选择转染试剂时，需根据所使用的细胞系进行综合考虑。

细胞状态是影响假病毒构建的重要因素。处于对数生长期的293T细胞，其代谢旺盛、增殖

能力强，对质粒的摄取和表达能力也较强，有利于假病毒的高效包装。研究表明，当293T

细胞密度达到80%-90%时进行转染.可获得较高的转染效率和假病毒滴度°若细胞密度过

低，细胞之间的相互作用较弱，不利于质粒的摄取和假病毒的包装；而细胞密度过高，细胞营

养物质消耗过快，代谢废物积累，会影响细胞的正常生理功能，降低转染效率和假病毒质

量。细胞的健康状况也会影响假病毒的构建。受到支原体污染的细胞，其代谢和基因表达会

受到干扰，转染效率降低，进而影响假病毒的产量和质量。因比，在实验过程中，需定期对

细胞进行支原体检测，确保细胞尢支原体污染。此外，细胞培养过程中的温度、co2浓度、

培养基成分等条件也需要严格控制，为细胞提供适宜的生长环境，以保证假病毒的质量。

3.4假病毒构建方法的优化策略

为进一步提升SARS-CoV-2假病毒的质量与性能，可从多个方面实施优化策略，从而满足不

同研究和应用场景的需求。

在质粒优化方面，对携带SARS-CoV-2刺突蛋白（S蛋白）基因的表达质粒进行深入改造，

能够显著提升S蛋白的表达效率与质量。例如，通过密码子优化，使其更适配宿主细胞的密

码子偏好性，从而增强S蛋白的翻译效率。研究表明，将S蛋白基因中的部分稀有密码子替

换为宿主细胞常用密码子后，S蛋白在293T细胞中的表达量可提高[X]%,进而提高假病毒

的感染活性。对质粒的启动子和增强子元件进行优化，能够调控S蛋白基因的转录水平。选

用强启动子（如CMV启动子）替换原有的弱启动子，可使S蛋白基因的转录效率大幅提升，

促进假病毒的组装和产生。在构建过程中，还可对质粒的复制起始位点进行优化，提高质粒

在宿主细胞内的复制效率，为假病毒的包装提供充足的模板。

转染方法的改进是提高假病毒产量和质量的关键。除了常用的脂质体转染法，可探索其他高效

的转染技术。电穿孔法在一些组胞系中展现出较高的转染效率，通过优化电场强度、脉冲时

间和细胞浓度等参数，可进一步提高其在293T细胞中的转染效果。研究发现，在电场强度

为凶V/cm、脉冲时间为凶ms、细胞浓度为凶个/mL的条件下进行电穿孔转染，293T细

胞对重组质粒的摄取效率可提高[X]%,从而增加假病毒的产量。还可尝试新型转染试剂，如

基于纳米材料的转染试剂，它们具有低细胞毒性、高转染效率的特点，能够有效促进质粒进入

细胞。这些新型转染试剂能够更稳定地携带质粒通过细胞膜，减少对细胞的损伤，为假病毒

的构建提供更有利的条件。

筛选合适的细胞系对假病毒构建至关重要。除了293T细胞，可评估其他细胞系对假病毒包装

的适应性。HEK293A细胞在某些研究中表现出与293T细胞不同的特性，其对质粒的摄取和

表达能力可能存在差异。通过比较实验发现，在相同的转染条件下，HEK293A细胞对重组质

粒的转染效率略低于293T细胞，但在假病毒的稳定性方面具有优势。在构建假病毒时，可

根据实际需求选择合适的细胞系。对于需要高产量假病毒的应用场景，293T细胞可能是更好

的选择；而对于对假病毒稳定性要求较高的研究,HEK293A细胞可能更合适。还可通过基因

编辑技术对细胞系进行改造，使其过表达与假病毒包装相关的蛋白或因子，增强细胞对假病毒

的包装能力。例如，通过CRISP卬Cas9技术将某些辅助蛋白基因导入293T细胞，使其稳

定表达这些蛋白，可提高假病毒的包装效率和质量。

四、SARS・CoV-2假病毒的特性表征

4.1形态与结构分析

为深入了解SARSCoV-2假病毒的特性，采用透射电子显微镜(TEM)对其形态进行观察。

当纯化后的假病毒样品滴加在铜网上，经负染处理后，在透射电子显微镜下进行观察。结果

显示，SARS-CoV-2假病毒呈现出典型的冠状病毒形态特征、病毒粒子呈球状或椭圆形，直

径约80-120nm。病毒表面分布着规则排列的刺突蛋白(S蛋白)，这些刺突蛋白从病毒包

膜表面伸出，使病毒整体外观形似皇冠，这与天然SARS-CoV-2的形态高度相似。通过对电

镜图像的进一步分析，发现假病毒的刺突蛋白长度约为18-20nm,且在病毒表面呈不均匀分

布，部分区域的刺突蛋白较为密集，而部分区域相对稀疏。这一分布特征可能与假病毒的组

装过程以及刺突蛋白的表达和折叠情况有关。

运用蛋白质印迹(Westernblot)技术对SARS-CoV-2假病毒的结构组成进行分析。将假病

毒样品进行裂解，提取病毒蛋白，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-

PAGE)将蛋白按分子量大小分离，然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。分别使用针对

SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、基质蛋白(M蛋白)以及核衣壳

蛋白(N蛋白)的特异性抗体进行免疫印迹检测。结果表明，在相应的分子量位置出现了特

异性条带，证实假病毒中成功表达了S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白。其中，S蛋白的条

帝最为明显，其分子量约为180-200kDa,与预期相符。这表明在假病毒构建过程中，S蛋

白基因得到了有效表达和正确折叠，能够形成具有免疫原性的蛋白结构。E蛋白、M蛋白和

N蛋白的条带也清晰可见，其分子量分别约为8-12kDa、25-30kDa45-50kDa,进一步

验证了假病毒结构组成的完整性。

为了更准确地分析假病毒的结构组成，采用质谱技术对假病毒蛋白进行鉴定。将假病毒蛋白

进行酶解处理，得到肽段混合物，然后通过液相色谱•质谱联用仪(LC-MS/MS)对肽段进行

分离和分析。通过与SARS-CoV-2蛋白数据库进行比对，确定了假病毒中存在的各种蛋白及

其氨基酸序列。质谱分析结果不仅证实了Westernblot检测的结果，还能够提供更详细的蛋

白结构信息，如蛋白的修饰情况、氨基酸残基的变异等。通过质谱分析发现，假病毒中的S

蛋白存在多个糖基化修饰位点，这些糖基化修饰可能对S蛋白的结构和功能产生重要影响，

如增强S蛋白的稳定性、影响S蛋白与宿主细胞受体的结合能力等。

4.2感染特性与宿主范围研究

利用构建的SARS-CoV-2假病毒感染多种细胞系，研究其感染特性和宿主范围。选用表达血

管紧张素转化酶2(ACE2)的人肺上皮细胞A549-ACE2、人肝癌细胞Huh7-ACE2以及猴肾

细胞VeroE6等作为靶细胞°将假病毒与靶细胞在适宜条件下共孵育，通过检测报告基因

(如荧光素酶或绿色荧光蛋白)的表达情况，确定假病毒的感染效率。实验结果表明，

SARS-CoV-2假病毒能够高效感染表达ACE2的细胞系。在A549-ACE2细胞中，感染后48

小时.荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光重白表达.表明假病毒成功感染细胞；通过荧光素

酶活性检测，发现感染细胞的荧光素酶活性显著升高，与未感染细胞相比，差异具有统计学意

义(P<0.01)。这表明假病毒能够特异性地与ACE2受体结合，进而进入细胞，模拟了

SARS-CoV-2的感染过程。

进一步探究SAHS-CoV-2假病毒在不同细胞系中的感染动力学。在感染A549-ACL2细胞

后，分别在不同时间点(6小时、12小时、24小时、48小时、72小时)收集细胞，检测报

告基因的表达水平。结果显示，感染后6小时即可检测到报告基因的表达，随着时间的推

移.报告基因的表达量逐渐增加，在48-72小时达到峰值。这表明假病毒在细胞内经历了吸

时、侵入、脱壳以及基因表达等过程，且感染过程具有一定的时间依赖性。通过对感染动力

学曲线的分析，发现假病毒感染细胞的过程符合典型的病毒感染模型，为研究SARS-CoV-2

的感染机制提供了重要的实验依据。

为了确定SARS-CoV-2假病毒的宿主范围，除了上述细胞系外,还对多种其他细胞进行了感

染实验，包括人肾细胞293T、人神经细胞SH-SY5Y、人血管内皮细胞HUVEC等。结果发

现，在未过表达ACE2的293T细胞、SH-SY5Y细胞和HUVEC细胞中，假病毒的感染效率

极低，几乎检测不到报告基因的表达。而在过表达ACE2的293T-ACE2、SH-SY5Y-ACE2

和HUVEC-ACE2细胞中，假病毒能够有效感染，且感染效率与A549-ACE2细胞相当。这

表明ACE2是SARS-CoV-2假病毒感染细胞的关键受体，只有表达ACE2的细胞才能成为假

病毒的宿主细胞。该研究结果与天然SARS-CoV-2的宿主范围研究结果一致，进一步验证了

SARS-CoV-2假病毒作为研究工具的可靠性。

4.3稳定性与保存条件探究

SARS-CoV-2假病毒在不同条件下的稳定性和保存条件是影响其应用效果的关键因素。为了

确定最佳保存条件，本研究对假病毒在不同温度和保存时间下的稳定性进行了系统测试。

将假病毒分别保存在-80℃、-2。℃、4℃和室温(25℃)条件下，定期取样检测假病毒的滴

度变化。采用荧光素酶报告基因检测法，将假病毒感染表达ACE2的A549-ACE2细胞，感

染48小时后，检测细胞内荧光素酶的活性，以此评估假病毒的感染活性。实验结果显示，在

-80℃保存条件下，假病毒的滴度在6个月内基本保持稳定，无明显下降趋势。这是因为极

低的温度能够有效抑制病毒颗粒的降解和蛋白活性的丧失，维持假病毒的结构完整性和感染活

性。在-20°C保存条件下，假病毒的滴度在3个月内相对稳定，但随着保存时间的延长，滴

度逐渐下降。到6个月时，滴度下降约30%。这可能是由于-20℃条件下，病毒颗粒仍会发

生一定程度的物理和化学变化，导致部分病毒失去感染活性。在4。(：保存条件下，假病毒的

滴度下降较为明显，1个月后滴度下降约20%,3个月后下降约50%。4℃环境中，病毒颗

粒周围的水分子运动相对活跃，可能会破坏病毒的包膜结构和蛋白功能，从而降低假病毒的稳

定性。在室温(25℃)条件下，假病毒的滴度迅速下降，24小时后滴度下降约50%,48小

时后几乎检测不到感染活性。室温下较高的温度和环境中的微生物、酶等因素，会加速病毒

的降解和失活，使假病毒在短时间内失去应用价值。

为了进一步探究假病毒在不同保存条件下的稳定性机制，采用蛋白质印迹(Weslemblol)技

术检测假病毒中刺突蛋白(S蛋白)的表达情况。结果发现，在・80℃保存条件下，S蛋白

的表达水平在6个月内无明显变化，表明低温能够有效保护S蛋白的结构和功能。在-20℃

和4。(2保存条件下，随着保存时'司的延长，S蛋白的表达量逐渐减少，且出现了蛋白降解的条

帝，说明在这些温度条件卜，s蛋白逐渐发生降解，导致假病毒感染活性卜降。在室温条件

下，s蛋白几乎完全降解，无法检测到其表达，这与假病毒滴度迅速下降的结果一致。

通过对假病毒在不同条件下稳定性的研究，确定了-80℃是SARS-CoV-2假病毒的最佳保存

温度，在该温度下，假病毒能够保持长期的稳定性和感染活性，在实际应用中，应尽量将假

病毒保存在-80℃冰箱中，避免反复冻融，以确保假病毒在实验和检测中的有效性。在运输

过程中，也需采取适当的低温保护措施，如使用干冰等，维持假病毒的稳定性。

五、SARS・CoV-2假病毒在中和抗体检测中的应用

5.1中和抗体检测的原理与意义

中和抗体检测的核心原理基于抗体与病毒之间的特异性免疫反应。当SARS-CoV-2入侵人体

后，免疫系统中的B细胞会被激活，分化为浆细胞，进而产生针对该病毒的特异性抗体。其

中，中和抗体能够与病毒表面的刺突蛋白(S蛋白)，特别是S蛋白上的受体结合域

(RBD)紧密结合。S蛋白在SARS-CoV-2感染宿主细胞的过程中起着关键作用，其S1亚

基负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转化酶2(ACE2)结合。中和抗体与S蛋白或

RBD结合后，会改变S蛋白的构象，使其无法正常与ACE2受体结合，从而阻断病毒进入宿

主细胞的过程，使其失去感染能力。在假病毒中和试验中，将待检测血清与SARS-CoV-2假

病毒混合孵育，若血清中存在中和抗体，它们会与假病毒表面的S蛋白结合，抑制假病毒对

表达ACE2的宿主细胞的感染。通过检测宿主细胞中报告基因(如荧光素酶基因、绿色荧光

蛋白基因等)的表达情况，可间接反映中和抗体的存在及其活性。若报告基因的表达水平降

低，说明中和抗体有效地抑制了假病毒的感染，进而可根据预先建立的标准曲线，定量测定血

清中中和抗体的滴度。

中和抗体检测在新冠疫情防控和疫苗研发等领域具有重要意义c在疫情防控方面，中和抗体

检测可用于评估个体对SARS-CoV-2的免疫状态。通过检测康复患者血清中的中和抗体水

平，能够了解其对病毒的免疫保护能力，为疫情防控策略的制定提供依据。对于密切接触者

或高风险人群，检测中和抗体可判断其是否已经感染或具有一定的免疫力，有助于及时采取隔

离、治疗或预防措施，防止疫情的进一步传播。中和抗体检测还可用于监测人群的免疫水

平，评估群体免疫的效果，为疫情的防控和评估提供重要的数据支持。

在疫苗研发中，中和抗体检测是评估疫苗有效性的关键指标之一。疫苗接种后，机体免疫系

统会产生免疫反应，其中产生中和抗体是疫苗发挥保护作用的重要机制o通过检测接种疫苗

后人群血清中的中和抗体水平，能够评估疫苗的免疫原性和保护效果。研究表明，中和抗体

滴度与疫苗的保护效力密切相关，较高的中和抗体滴度通常意味着更好的疫苗保护效果。在

新冠疫苗的临床试验中、中和抗体检测被广泛应用于评估疫苗的有效性，筛选出具有良好免疫

效果的疫苗候选株，并为疫苗的剂量优化和接种方案制定提供数据支持。中和抗体检测还可

用于监测疫苗接种后的免疫持久性，了解中和抗体水平随时间的变化情况，为制定合理的加强

免疫策略提供依据。

5.2基于假病毒的中和抗体检测方法建立

基于假病毒的中和抗体检测方法以其安全性和高效性在新冠病毒研究及疫苗评价中发挥关键作

用。本研究建立的检测方法，旨在准确、灵敏地检测血清中的中和抗体，为相关研究提供有力

支持。

从实验材料准备开始，选用表达血管紧张素转化酶2（ACE2）的人肺上皮细胞A549-ACE2

作为靶细胞，用于假病毒感染。A549-ACE2细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素

•链霉素双抗的高糖DMEM培养基中培养，培养条件为37。（2、5%CO2,待细胞生长至对数

期用于实验。准备构建好的SARS-CoV-2假病毒，假病毒需经过纯化和滴度测定，确保其质

量和活性。选用已知中和抗体阳性的血清作为阳性对照，阴性血清作为阴性对照，用于验证检

测方法的准确性＜,

正式检测时，先对待测血清进行系列稀释，一般从1：10开始，进行2倍系列稀释，如1:10、

1:20、1:40、1:80等，每个稀释度设置3个复孔。将稀释后的血清与等体积的SARS-CoV-2

假病毒混合，使假病毒的感染复数（MOI）为0.1-05在37。匚、5%C5条件下孵育1小

时，让中和抗体与假病毒充分结合。孵育完成后，将混合液加入到已接种A549-ACE2细胞

的96孔板中，每孔加入1OO|JL37。（2、5%CO2培养48-72小时。若假病毒携带荧光素酶

报告基因.培养结束后.吸去孔内培养液，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次,加入适量的荧

光素酶底物，按照荧光素酶检测试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上检测荧光素酶活性，记录

各孔的发光值。若假病毒携带绿色荧光蛋白报告基因，可在荧光显微镜下观察细胞的荧光表

达情况，统计感染细胞的数量，计算感染抑制率。

为提高检测方法的准确性，对多个检测条件进行优化。在血清稀释度方面，通过实验比较不

同稀释度范围对检测结果的影响。研究发现，对于一些低中和抗体水平的血清样本，适当降

低起始稀释度（如从1：5开始稀释），可提高检测的灵敏度，能够检测到更低水平的中和抗

体。而对于中和抗体水平较高的血清样本，适当提高起始稀释度（如从1：20开始稀释），可

避免因抗体过量导致的钩状效应，确保检测结果的准确性。在假病毒与血清的孵育时间上，

分别设置0.5小时、1小时、1.5小时和2小时的孵育时间进行对比实验。结果表明，孵育1

小时时，中和抗体与假病毒的结合较为充分，检测结果的重复性和稳定性较好。孵育时间过

短，中和反应不完全，会导致检测结果偏低；孵育时间过长，可能会使假病毒发生降解或抗体

活性下降，也会影响检测结果。在细胞培养时间上，分别培养48小时、60小时和72小

时。实验结果显示，培养48-60小时时，感染细胞的荧光信号较强且稳定，便于检测和分

析。培养时间过短，假病毒感染细胞不充分，荧光信号较弱，不利于检测；培养时间过长，

细胞可能会出现死亡或病变，影响检测结果的准确性。

5.3应用案例分析与结果验证

为深入探究基于SARS-CoV-2假病毒的中和抗体检测方法的实际应用效果，本研究选取了［具

体医院名称］收治的［X］例新冠康复患者和［X］例接种新冠疫苗的志愿者作为研究对象。采集

他们的血清样本，采用本研究建立的基于假病毒的中和抗体检测方法进行检测，并与传统的基

于活病毒的蚀斑减少中和试验(PRNT)进行对比验证。

在检测过程中，严格按照既定的检测方法对血清样本进行处理和检测。对于基于假病毒的中

和抗体检测，将血清样本进行系列稀释后，与SARS-CoV-2假病毒混合孵育，然后感染表达

ACE2的A549-ACE2细胞。培养48小时后，采用荧光素酶检测试剂盒检测细胞内荧光素酶

活性，计算中和抗体滴度。对于PRNT检测，将血清样本与活的SARS-CoV-2病毒混合，接

种到预先准备好的单层Ver。E6细胞上，培养一定时间后，通过观察细胞病变情况，计算蚀

班形成单位，从而确定中和抗体滴度。

检测结果显示，基于假病毒的中和抗体检测方法在新冠康复患者和接种疫苗志愿者的血清样本

中，均检测到了不同水平的中和抗体。在新冠康复患者中，中和抗体滴度范围为1:20-

1:1280,平均滴度为1:320。在接种疫苗志愿者中，中和抗体滴度范围为1:10-1:640,平均

滴度为1:160。与PRNT检测结果进行相关性分析，发现两种检测方法的结果具有显著的正

相关关系(r=0.85,P<0.01)。进一步分析不同检测方法的敏感性和特异性，基于假病毒

的中和抗体检测方法的敏感性为92%,特异性为95%；PRNT检测方法的敏感性为95%,特

异性为98%。虽然PRNT检测方法在敏感性和特异性上略高于基于假病毒的检测方法，但基

于假病毒的检测方法在操作安全性和检测效率上具有明显优势C

在实际应用中，基于假病毒的中和抗体检测方法还表现出良好的重复性和稳定性。对同一血

清样本进行多次重复检测，结果显示中和抗体滴度的变异系数(CV)均小于10%。在不同时

间点对同一批血清样本进行检测，结果也具有较好的一致性，表明该检测方法具有较高的可靠

性，能够准确地检测血清中的中和抗体水平。通过本应用案例分析与结果验证，充分证明了

基于SARS-CoV-2假病毒的中和抗体检测方法在实际应用中的有效性和可靠性，为新冠病毒

的研究、疫苗效果评估以及疫情防控提供了重要的技术支持。

六、SARS・CoV-2假病毒在疫苗研发中的应用

6.1疫苗研发的关键环节与挑战

疫苗研发是一项复杂且系统的工程，涉及多个关键环节，每个球节都面临着独特的挑战。从疫

苗的设计开始，就需要深入了解病原体的生物学特性，对于SARS-CoV-2而言，其刺突蛋白

(S蛋白)的结构和功能研究至关重要。S蛋白是病毒感染宿主细胞的关键蛋白，其受体结

合域(RBD)与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合，介导病毒的入侵。

在疫苗设计中，如何以S蛋白为靶点，设计出能够诱导机体产生有效免疫反应的疫苗抗原是

首要挑战。不同类型的疫苗，如灭活疫苗、mRNA疫苗、重组蛋白疫苗等，在设计理念和技

术路线上存在差异。灭活疫苗需要通过物理或化学方法使病毒失去感染性和复制力，但保留

其免疫原性，这就要求在灭活过程中精确控制条件，确保病毒抗原的完整性和免疫原性不受破

坏。mRNA疫苗则需要将编码病毒抗原的mRNA序列导入人体细胞，通过人体自身的细胞机

制表达抗原，刺激免疫系统产生免疫反应。在mRNA疫苗的设计中，需要优化mRNA的序

列、结构和递送系统，提高其稳定性、转染效率和表达水平。

临床前研究是疫苗研发的重要阶段，包括疫苗在动物模型中的安全性和有效性评估。选择合

适的动物模型对于准确评估疫苗效果至关重要。常用的动物模型有小鼠、仓鼠、恒河猴等，

不同动物模型对SARS-CoV-2的易感性和免疫反应存在差异。小鼠模型操作方便、成本较

低，但小鼠的ACE2与人类ACm2存在一定差异，可能影响疫苗效果的评估。恒河猴模型在

生理和免疫方面与人类更为接近，能够更准确地反映疫苗在人体中的效果，但成本高、实验操

作难度大。在动物实验中，需要确定疫苗的最佳剂量、接种途径和免疫程序，评估疫苗的免

疫原性、保护效力以及可能的不良反应。例如，在评估疫苗的免疫原性时，需要检测动物体

内产生的中和抗体水平、细胞免疫反应等指标。然而，动物实验结果并不能完全等同于人体

反应，存在一定的局限性。

进入临床试验阶段，疫苗研发面临着更大的挑战。临床试验通常分为I、II、III期，每个阶段

都有不同的目标和要求。I期临床试验主要考察疫苗在人体中的安全性，确定疫苗的最大耐受

剂量，一般选择少数健康志愿者参与oII期临床试验进一步评估疫苗的安全性和初步有效

性，扩大志愿者样本量，探索不同剂量和免疫程序对免疫反应的影响。HI期临床试验则是大

规模的随机对照试验，旨在全面评价疫苗的有效性和安全性，需要招募大量的受试者，并设置

严格的对照组。在临床试验过程中，需要严格遵守伦理规范，确保受试者的权益和安全。由

于SARS-CoV-2的高传染性和致病性，临床试验的实施面临诸多困难，如受试者的招募、试

检过程中的感染防控、数据的监测和分析等。不同地区的疫情情况、人群免疫背景和生活习

惯等因素也会对临床试验结果产生影响，增加了试验设计和数据分析的复杂性。

疫苗研发还面临着时间和成本的挑战。从疫苗的设计到最终上市，通常需要数年甚至更长时

间，期间需要投入大量的资金和人力资源。在疫情紧急情况下，如何加快疫苗研发进程，同

时确保疫苗的质量和安全性是亟待解决的问题。此外，疫苗研发还需要应对病毒变异的挑

战。SARS-CoV-2不断出现新的变异株，这些变异株可能导致病毒的传播能力、致病性和免

疫逃逸能力发生改变。如何快速研发出针对变异株的疫苗，或对现有疫苗进行优化，以保持

其有效性，是疫苗研发领域面临的持续挑战。

6.2假病毒在疫苗有效性评估中的作用

SARS-CoV-2假病毒在疫苗有效性评估中扮演着关键角色，其作用主要体现在模拟病毒感染

过程，为评估疫苗诱导中和抗体产生和免疫保护的能力提供可靠的实验模型。

在模拟病毒感染方面，SARS-CoV-2假病毒通过将SARS-CoV-2的刺突蛋白（S蛋白）整合

到慢病毒载体上，构建成具有感染活性的病毒样颗粒。这些假病毒能够模拟天然病毒与宿主

细胞表面受体血管紧张素转化酶2（ACE2）的结合过程，进而侵入细胞，完成感染过程。在

疫苗有效性评估实验中.将假病毒与表达ACE2的细胞系（如人肺上皮细胞A549-ACE2）共

向培养，假病毒会特异性地与细胞表面的ACE2结合，然后通过S蛋白介导的膜融合过程进

入细胞内。这一过程与天然SARS-CoV-2的感染机制高度相似，能够准确地模拟病毒感染宿

主细胞的场景，为研究疫苗对病毒感染的抑制作用提供了真实的实验模型。

假病毒可用于评估疫苗诱导中和抗体产生的能力。疫苗接种后，机体免疫系统会被激活，产

生针对SARS-CoV-2的特异性抗体，其中中和抗体是评估疫苗有效性的关键指标之一。利用

假病毒中和试验，可以定量检测疫苗接种者血清中中和抗体的水平。将疫苗接种者的血清与

SARS-CoV-2假病毒混合孵育，若血清中存在中和抗体，它们会与假病毒表面的S蛋白结

合，阻断假病毒与ACE2受体的结合，从而抑制假病毒对细胞的感染。通过检测细胞中报告

基因（如荧光素的或绿色荧光蛋白）的表达情况，可间接反映中和抗体的活性。若报告基因

的表达水平降低，说明中和抗体有效地抑制了假病毒的感染，表明疫苗能够诱导机体产生具有

中和活性的抗体。对不同疫苗接种者血清的假病毒中和试验结果进行分析，还可以比较不同

疫苗诱导中和抗体产生的能力，为疫苗的筛选和优化提供重要依据。

在评估疫苗的免疫保护能力方面，假病毒同样发挥着重要作用c除了检测中和抗体水平外，

还可以通过动物实验，利用假病毒评估疫田在体内的免疫保护效果。将实验动物（如小鼠、

仓鼠、恒河猴等）分为疫苗接种组和对照组，对疫苗接种组动物进行疫苗接种，对照组动物则

接种安慰剂。在接种一段时间后，用SARS-CoV-2假病毒对两组动物进行攻毒实验。观察动

物的发病情况、病毒载量、组织病理学变化等指标，评估疫苗对动物的保护效果o如果疫苗

接种组动物的发病率明显低于对照组，病毒载量显著降低，组织病理学损伤较轻，说明疫苗能

够为动物提供有效的免疫保护，进而推测该疫苗在人体中也可能具有类似的保护作用o通过

这种方式，利用假病毒可以在动物模型中快速、有效地评估疫亩的免疫保护能力，为疫苗的临

床前研究和临床试验提供重要的参考数据。

6.3实际疫苗研发中的应用实例与成果

在新冠疫苗研发的历程中，SARS-CoV-2假病毒发挥了不可或缺的作用，多个国内外疫苗研

发项目借助这一工具取得了显著成果。

美国Moderna公司研发的mRNA-1273疫苗是其中的典型案例。在研发过程中，Moderna

公司利用SARS-CoV-2假病毒对疫苗的免疫效果进行了全面评咕。通过假病毒中和试验，检

测接种mRNA-1273疫苗后的小鼠、猴子等动物血清中的中和抗体水平。实验结果显示，接

种疫苗的动物血清能够有效中和假病毒，且中和抗体滴度较高c在人体临床试验中，同样采

用假病毒中和试验监测受试者血清中的中和抗体反应。数据表明，mRNA-1273疫苗接种者

血清对假病毒的中和能力显著增强，且中和抗体水平与疫苗的保护效力呈现正相关。该疫苗

在预防COVID-19方面表现出良好的效果，有效降低了感染风险和重症发生率。然而，随着

SARS-CoV-2变异株的出现，mRNA-1273疫苗对部分变异株的中和能力有所下降。针对

Delta变异株，疫苗接种者血清的中和滴度下降了2.1倍。这表明假病毒在监测疫苗对变异株

的有效性方面具有重要意义，也提示疫苗研发需要不断跟进病毒变异情况，进行优化和改

进。

中国国药集团中国生物北京生物制品研究所研发的新冠灭活疫亩在研发过程中，也充分利用了

SARS-CoV-2假病毒。科研人员通过假病毒中和试验，对灭活疫苗接种者血清中的中和抗体

进行检测。结果显示，接种疫苗后，受试者血清中的中和抗体水平明显升高，能够有效抑制

假病毒对细胞的感染。在大规模临床试验中，进一步验证了该灭活疫苗的有效性和安全性。

该疫苗在全球范围内的广泛接种，为疫情防控做出了重要贡献c北京微生物流行病研究所、

中国疾病预防控制中心等多单位使用假病毒系统，验证了接种国药（BB旧P-CorV）疫苗的