TGF-1基因促进人平滑肌细胞与内皮细胞粘附研究

TGF-pi基因促进人平滑肌细胞与内皮细胞粘附研究贾后军,王子卫(重庆医科大学附属第一IK院普外科,重庆400016)摘要:目的探讨转化生长因子TGF-p!基因作用于平滑肌细胞从而促进内皮细胞粘附的研究。方法DOTAP脂质体转染pMAMneoTGF-pi于原代培养的平滑肌细胞,经G418筛选。检测转染pMAMneoTGF-pi和转染pMAMneo的平滑肌细胞粘附内皮细胞的情况。结果经G418筛选,转染pMAMneoTGF-P,组转化生长因子TGF-p,基因在平滑肌细胞得到有效表达,平滑肌细胞表面有大量内皮细胞粘附,而对照组平滑肌细胞仅有少量内皮细胞粘附,两者相差非常显著(p<0.01)°结论转化生长因子TGF(5.基因能有效作用于血管平滑肌细胞从而促进内皮细胞粘附,在血管再生中将具有重要作用。【关键词1TGF-betal基因；平滑肌细胞;内皮细胞;粘附作者简介：贾后军,男,湖北洪湖市人,汉族,博士,讲师,主要从事普通外科基础与临床方面的研究。Email:；Tel:TGF-betalincreaseendothelialcellsadhesiontoSmoothMuscleCellsJiaHou-jun,WangZi-wei(DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016)Abstract:ObjectiveToexaminetheeffectivenessofTGF-betalincreaseendothelialcellsadhesiontoSmoothMuscleCells.MethodsWith(hehelpofDOTAP,smoothmusclecellswastransfectedwithpMAMneoTGF-阮ThepostivecellcloneswereselectedwithG418andtheexpressionofTGF-piweredetectedbyfluorescenceanalysismethods.Theadhesioncellnumberintransfectedcellsweredeterminedbymicroscopeanalysis.ResultsTGF-P)genecanincreaseendothelialcellsadhesiontoSmoothMuscleCells.ConclusionTGFpigenecanbehelpfulfbrthevasculartissueengineering.Keywords:TGF-betalgene;smoothmusclecells;adhesion;endothelialcells血管再生在缺血性疾病血管重建中非常重要,内皮细胞和平滑肌细胞是血管重建的重要种子细胞,而种子细胞与基质材料的粘附是目前研究的热点,如何促进内皮种子细胞粘附是血管再生的重要问题,加强内皮细胞与平滑肌细胞的相互作用研究是血管再生的重要环节⑴。目前研究主要集中在用纤粘蛋白、胶原及粘附短肽等加强材料裱衬,从外部因素促进细胞粘附。研究表明转化生长因子(TGF-p)能明显提高血管平滑肌细胞弹性蛋白的表达以及显著提高平滑肌细胞与基质的粘附力〔24,本实验将TGF-p,基因转入平滑肌细胞,探讨其是否通过分泌细胞外基质蛋白进而促进内皮细胞粘附,旨在为血管再生的研究提供新的理论机制。1材料和方法1.1质粒、试剂和细胞系1.1.1载体系统:pMAMneoTGF-p!质粒由第三军医大学解剖学教研室李立博士惠赠。1.1.2质粒抽提试剂盒购自上海生工公司,限制性内切酶为华美生物公司产品,DOTAP脂质体转染试剂为Roche公司产品,DMEM培养基及胎牛血清购自HLycone公司,G418购自美国Gibico公司。TGF-p,»抗人抗体购自博士德公司。1.1.3细胞系：人脐动脉平滑肌细胞：培养条件为1640培养基,20%小牛血清,37°C,5%CCh。人脐静脉内皮细胞：培养条件为M199培养基,含20%胎牛血清,37,C,5%CO2.1.2原代人平滑肌细胞培养无菌条件下取胎儿脐动脉约10CM,以D-hanks液冲洗管腔清除血凝块,然后分离脐动脉,在手术显微镜下用显微器械去掉脐动脉内膜外膜,保留中膜备用。剪取一小块中膜组织,采用多种酶混合消化法(大豆胰蛋白酶抑制剂1mg/niL弹性蛋白酶1mg/mi,胶原酶3mg/mL牛血清白蛋白1nig/ml)分离血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMC),在低血清164()培养液中进行培养,培养条件为1640培养基,20%小牛血清,37C,5%CO2<,采用免疫组织荧光化学染色方法鉴定原代培养的人平滑肌细胞,以a-SM-actin(S-actin)抗体作单抗。1.3质粒pMAMneoTGF-Pi转染原代平滑肌细胞和G4I8抗性细胞筛选、培养:1.3.1质粒pMAMncoTGF-p.的转染:将原代培养的平滑肌细胞消化后直接种植在大的载玻片上,采用DOTAP脂质体介导的转染方法,将pMAMneoTGF$质粒转染到原代培养的人平滑肌细胞中,1。小时后弃去转染液,换低血清的1640培养液继续培养1〜2天。1.3.2G418抗性细胞筛选：弃去原培养液,用含有3()0ug/mlG418的1640培养液进行培养,7天后筛选收集G418抗性细胞,并在倒置显微镜下进行动态观察。1.3.3未转染pMAMncoTGF-pi质粒的原代平滑肌细胞及转染pMAMnco的原代平滑肌细胞同样用含有300ug/mlG418的1640培养液进行培养。选抗G418阳性克隆细胞用于后续实验研究。1.4内皮细胞分离培养无菌条件下取人脐静脉约10CM,以D-hanks液冲洗脐静脉管腔以清除血凝块,用酶消化法分离内皮细胞,加入M199培养液培养。培养条件为M199培养基,含20%胎牛血清,37°C,5%CO2。1.4内皮粘附实验将内皮细胞消化后分离,然后以1000个细胞每孔分别种植于实验组和对照组平滑肌细胞上,半小时后加入PBS进行清洗,粘附细胞进行共培养12小时后再次清洗再计数,高倍镜下进行计数,平均计数12个视野。1.5统计学方法：所有数据均以均数土标准差表示,采用SPSS11.0统计分析软件对各组数据进行t检验分析,p<0.05表示相差显著,pvO.OI表示相差非常显著。2结果2.1平滑肌细胞、内皮细咆分离培养分离培养的内皮细胞形如鹅卵石,分布均匀,状态良好(图1a);经内皮细胞vm因子免疫荧光染色,胞浆阳性染色呈红色荧光,胞核呈圆形居中(图lb)。本实验分离人脐动脉中膜组织,采用多种酶混合消化方法分离血管平滑肌细胞,镜下观察见原代平滑肌细胞呈梭形,部分呈条索状,存活状态良好,并且纯度较高(图1C);通过a-SM-actin(S-actin)抗体作行免疫组织荧光染色,证实上述形态细胞皆为平滑肌细胞。2.2TGF-pi基因表达细胞抗性筛选经DOTAP介导质粒转染,G418加压筛选,筛选出抗G418阳性且TGF-山基因超表达的细胞。本实验经TGF-p.鼠抗人抗体作一抗行免疫组织荧光染色,咆浆中有很强的红色荧光,显示转染pMAMneoTGF-p)平滑肌细胞加压筛选后表达TGF-pi(图1d)。h/cd图】a内皮细胞原代培养;b内皮细胞圳1因子免疫荧光鉴定;c平滑肌细胞原代培养;d转染

pMAMneoTGF-Pi平滑肌细胞加压筛选后表达TGF-p）2.3内皮细胞粘附实验结果表明转染pMAMneo组及正常对照组平滑肌细胞表面仅有少量内皮细胞粘附,而转染pMAMncoTGF-p.实验组平滑肌细胞表面有大量内皮细胞粘附,两者相差非常显著(pvO.Ol)。图2转染pMAMncoTGF-pj和pMAMnco的平滑肌细胞粘附内皮细胞的情况3讨论血管内皮细胞和平滑肌细胞是血管再生的重要种子细胞,如何促进内皮种子细胞粘附是血管再生的重要问题,而血管再生在缺血性疾病血管重建中非常重要,我们的实验表明将TGF-P,基因转入平滑肌细胞,将能有效促进内皮细胞粘附,为血管再生研究提供了资料。研究表明TGF书经过酶解后获得具有活性的TGF-P同源二聚体,它以二硫键将两条含有112个氨基酸的肽链连接起来,分子量为25KD。TGF-p有多种亚型,其中在人类中主要有3种,分别为TGF-阳TGF仙、TGF-p3oTGF-p具有广泛生物学作用,在细胞生长、分化、肿瘤增殖、血管形成中起重要作用,那么在血管再生方面有否作用呢?内皮细胞和平滑肌细胞是血管重建的重要种子细胞,而种子细胞与基质材料的粘附是目前研究的热点。研究表明TGF书不仅能明显提高血管平滑肌细胞弹性蛋白的表达并能增强平滑肌细胞与基质的粘附力,此外TGF-D可明显加强平滑肌细胞的增殖,同时有一定的量效关系注淄。为促进血管再生或改善血管的血液相容性,促进内皮细胞种植是促进血管再生的有效方法,FI前研究主要集中在用各种支架材料裱衬细胞外基质如胶原、层粘连蛋白、纤粘蛋白等,其能加速内皮细胞种植,从而促进血管化都取得了满意的效果。用同种细胞外基质（ECM）包被生物材料后发现,能显著提高其吸附细胞的能力（提高48%）,这些结果说明细胞外基质成分能增加细胞的粘附力。如果能通过促进基底细胞分泌这些细胞外基质将能有效促进表层细胞的粘附。而TGF-p!能显著加强细胞分泌细胞外基质,说明其可能在促进内皮细胞粘附方面能发挥重要作用。本实验检测到TGF-p,基因作用后平滑肌细胞能显著提高内皮细胞粘附,说明运用此方法可显著加强内皮种子细胞种植,该方法可以起到类似于在基质材料表面裱衬粘附蛋白的效果。因TGF-p!作用平滑肌细胞后可以影响很多细胞外基质合成⑺,因而本实验检测平滑肌细胞与内皮细胞的粘附不能排除其分泌的因子同时促进内皮细胞分泌细胞外基质,有待下一步研究。总之,本实验结果说明在促进内皮化时通过TGF-P.基因转染大力发挥平滑肌细胞的作用将能起到很好的效果,在血管再生中具有重要意义。[参考文献IPeppasHA,LanserR.Newchallengesinbiomaterials[J].Science,1994,263(1):715.WangX,HuG,BettsC,etal.TransformingGrowthFactor-pi-inducedTranscript1Protein,aNovelMarkerforSmoothMuscleContractilePhenotype.IsRegulatedbySerumResponseFactor/MyocardinProtein[J].JBiolChem,2011,286(48):41589-99.13]MestriesP,AlexakisC,Papy-GarciaD,etal.SpecificRGTAincreasescollagenVexpressionbyculturedaorticsmoothmusclecellsviaactivationandprotectionoftransforminggrowthfactor-betal[J].Matrix-Bioi,2001,20(3):171.[4]DerkachDN,WadekarSA,PerkinsKB,etal.RGD-dependentbindingofTP508tointegrinalphavbeta3mediatescelladhesionandinductionofnitricoxide[J].ThrombHaemost,2010,104(1):172-82.|5]OllandJ,HershL,BryhanM,ctal.CultureofhumanvascularendothelialcellsonanRGD-containingsyntheticpeptideattachedtoastarch-coatedpolystyrenesurface:comparisonwithfibroncctin-coatcdtissuegradepolysty-rcnc[J].Biomatcrials,1996,17(22):2147.[6]MarigoV,VolpinD,VitaleG,ctal.IdentificationofaTGF-presponsive