生物制品pH值测定指南（试行）

生物制品pH值测定指南（试行）1适用范围本指南适用于预防用生物制品（灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、重组蛋白疫苗、佐剂疫苗等）、治疗用生物制品（单克隆抗体、双特异性抗体、细胞因子、融合蛋白、细胞治疗产品、基因治疗产品等）、血液制品（人血白蛋白、静注人免疫球蛋白、凝血因子类制品等）、体外诊断用生物制品（抗原、抗体、校准品、缓冲液组分等）的原液、中间体、半成品、成品的pH值测定，也适用于生物制品生产过程中工艺用水、中间产物的pH值监测。非水相生物制品、强腐蚀性生物制品的pH值测定不适用于本指南，可根据产品特性参考本指南制定专属测定方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法JJG119-2018实验室pH（酸度）计检定规程《病原微生物实验室生物安全管理条例》（2018年修订）《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》3术语和定义3.1pH值：溶液中氢离子活度的负对数，计算公式为pH=-lgα_H+，表征溶液的酸碱度，是生物制品质量控制的关键指标之一，直接影响生物制品的稳定性、活性、免疫原性。3.2温度补偿：pH计根据测定温度自动或手动调整能斯特方程斜率，消除温度对电极响应值的影响的操作，仅补偿电极的响应偏差，不改变样品本身的实际pH值。3.3两点校准：采用两种pH值相差至少3个单位的标准缓冲液对pH计的定位和斜率进行校准的操作，是常规pH测定的首选校准方法。3.4液接界电位：参比电极内充液与待测溶液接触时产生的电位差，是pH测定误差的主要来源之一，受内充液浓度、溶液离子强度、液接界通畅性影响。3.5电极斜率：电极响应电位变化与pH值变化的比值，25℃下理论值为59.16mV/pH，合格电极的斜率应达到理论值的95%~105%。4基本原理本指南推荐采用玻璃电极法测定pH值，测定系统由指示电极（玻璃电极）、参比电极（甘汞电极或银-氯化银电极）、待测溶液组成，也可采用集成指示电极、参比电极、温度传感器的复合电极。玻璃电极的敏感膜由特殊玻璃材质制成，浸泡活化后膜表面形成水化凝胶层，可与溶液中的氢离子发生选择性交换，产生膜电位；参比电极的电位不受待测溶液组分影响，为测定系统提供稳定的基准电位。两电极浸入待测溶液后形成原电池，总电动势符合能斯特方程：E=E₀+(2.303RT/F)lgα_H+=E₀-(2.303RT/F)pH其中：E为原电池总电动势，单位为mV；E₀为标准电极电位，单位为mV；R为气体常数，取值8.314J/(mol·K)；T为热力学温度，单位为K；F为法拉第常数，取值96485C/mol。在恒定温度下，原电池总电动势与待测溶液pH值呈线性相关，通过测定已知pH值的标准缓冲液的电动势，校准pH计的定位和斜率后，即可直接读取待测溶液的pH值。5仪器与试剂5.1仪器5.1.1pH计：应符合JJG119-2018的检定要求，根据测定精度需求选择对应级别：常规半成品、成品pH测定选用0.01级pH计（最小分度值0.01pH），原液、高纯度生物制品、工艺稳定性研究样品选用0.001级pH计（最小分度值0.001pH）。pH计应具备自动或手动温度补偿功能，测定范围覆盖1~14pH。5.1.2电极：常规样品选用含银-氯化银参比的玻璃复合电极；含氟离子浓度高于0.1mmol/L的样品选用耐氟玻璃电极或塑料膜电极；高粘度蛋白、脂质样品选用大孔液接界复合电极，避免液接界堵塞；细胞治疗产品、核酸疫苗样品选用低吸附聚丙烯外壳复合电极，避免活性组分吸附。电极应在检定有效期内使用。5.1.3测温装置：采用分度值≤0.1℃的精密水银温度计或铂电阻温度传感器，定期经计量校准。5.1.4辅助设备：磁力搅拌器（转速可调，配备聚四氟乙烯搅拌子）、恒温水浴装置（控温精度±0.5℃）、10~50mL低吸附聚丙烯烧杯、生物安全柜（适用于含生物危害性的样品测定）。5.2试剂5.2.1实验用水：符合GB/T6682-2008的一级水要求，25℃下电阻率≥18.2MΩ·cm，无有机物、微生物、二氧化碳污染，临用前煮沸10min除去溶解的二氧化碳，密封冷却至室温后使用。5.2.2标准缓冲液：应优先选用中国食品药品检定研究院核发的pH标准物质，或按《中华人民共和国药典》2025年版三部规定的方法配制，常用标准缓冲液的组分及不同温度下的pH值见表1。标准缓冲液配制后应密封置于4℃避光保存，有效期不超过3个月，出现浑浊、沉淀、发霉现象时立即废弃。表1常用标准缓冲液不同温度下的pH值温度（℃）0.05mol/L草酸盐缓冲液0.05mol/L邻苯二甲酸氢钾缓冲液0.025mol/L混合磷酸盐缓冲液0.01mol/L硼砂缓冲液饱和氢氧化钙缓冲液（25℃）01.674.006.989.4613.4251.674.006.959.4013.21101.674.006.929.3313.00151.674.006.909.2812.81201.684.006.889.2312.63251.684.006.869.1812.45301.684.016.859.1412.29351.694.026.849.1012.13401.694.036.849.0711.985.2.4电极清洗液：针对不同污染物选择：蛋白污染物选用0.1g/L中性蛋白酶磷酸盐缓冲液；脂质污染物选用75%乙醇溶液；无机盐沉积物选用0.1mol/L稀盐酸溶液。6人员要求6.1操作人员应经过生物制品检验操作、pH测定原理及操作、生物安全防护的专项培训，考核合格后方可上岗。6.2操作人员应熟悉所测定生物制品的质量标准、生物安全等级，掌握pH计校准、电极维护、异常数据识别的相关技能。6.3涉及高致病性病原微生物、基因治疗产品、血液来源制品的测定，操作人员应符合对应生物安全等级的操作资质要求。7操作步骤7.1测定前准备7.1.1样品前处理不同类型生物制品的前处理应符合以下要求：①澄清液体样品（单抗制品、细胞因子、血液制品原液/成品、无佐剂疫苗等）：密封包装样品开封后立即取样，避免空气中二氧化碳溶解导致pH偏低；样品含气泡时，静置5min或低速离心（300r/min，1min）脱气，不得超声脱气避免活性组分变性；需控制测定温度的样品，置于恒温水浴中平衡30min，温度波动≤±0.5℃。②混悬型样品（铝佐剂疫苗、脂质纳米颗粒疫苗、细胞悬液等）：取样前轻轻颠倒混匀10次，避免剧烈振摇产生气泡；铝佐剂样品不得离心去除沉淀，需保持混悬状态测定；CAR-T、NK细胞等细胞治疗产品取样后10min内完成测定，避免细胞代谢改变溶液pH，测定时搅拌速度≤100r/min，避免细胞损伤。③固体/冻干粉样品：按产品说明书规定的复溶溶剂、复溶比例、复溶温度操作，轻轻旋转至完全溶解，无肉眼可见不溶物后测定；无明确复溶要求的样品，用无缓冲0.9%氯化钠溶液复溶至固形物浓度为10g/L，测定时备注复溶条件。④含生物危害性样品（减毒活疫苗、菌苗、血液来源未知的样品、基因治疗产品等）：全部操作在对应等级的生物安全柜内进行，穿戴一次性手套、防护服、护目镜，避免样品溢洒产生气溶胶。7.1.2仪器准备pH计提前开机预热30min，确认仪器在检定有效期内；新电极或停用超过7天的电极，置于3mol/L氯化钾溶液中浸泡24h活化，临用前用一级水冲洗3次，用无尘滤纸吸干电极表面水分，不得擦拭玻璃敏感膜避免刮花或产生静电。7.1.3仪器校准优先采用两点校准法，校准步骤如下：①选择两种标准缓冲液，待测样品的pH值应处于两种缓冲液pH值之间，且两种缓冲液的pH值相差≥3个单位，例如待测样品pH为7.0~7.5时，选用0.025mol/L混合磷酸盐缓冲液（25℃pH6.86）和0.01mol/L硼砂缓冲液（25℃pH9.18）。②测定第一种标准缓冲液的温度，将温度值输入pH计（或采用自动温度补偿功能），将电极浸入缓冲液，开启低速搅拌，待读数稳定（30s内变化≤0.01pH）后，调节定位参数至该温度下的标准pH值。③取出电极，用一级水冲洗3次，吸干水分后浸入第二种标准缓冲液，待读数稳定后调节斜率参数至该温度下的标准pH值。④重复校准操作2~3次，两种标准缓冲液的测定值与标准值的偏差均≤±0.02pH时，判定校准合格；若偏差超出范围，应更换标准缓冲液或检查电极性能，重新校准。待测样品pH范围跨度≥7个单位时，采用三点校准法，依次使用酸性、中性、碱性三种标准缓冲液校准，校准后三种缓冲液的测定偏差均≤±0.02pH即为合格。校准有效期：每次测定前需完成校准，连续测定≥10个样品时，每测定10个样品插入质控缓冲液回测，回测值与标准值偏差≥±0.03pH时，需重新校准。7.2样品测定①校准合格后，用一级水冲洗电极3次，吸干水分，取不少于10mL待测样品置于干燥的低吸附烧杯中，电极浸入样品液面下至少5mm，避免电极接触烧杯底部或侧壁。②开启低速搅拌，搅拌速度以不产生气泡为准，待读数稳定后记录pH值及测定温度。③取出电极，用一级水冲洗3次，吸干水分后测定平行样，同一样品平行测定2次，平行样偏差要求：澄清液体样品≤0.02pH，混悬型样品≤0.05pH，高粘度蛋白样品≤0.04pH，偏差超出范围时重新取样测定。④含生物危害性的样品测定完成后，将电极浸入0.5%次氯酸钠溶液中浸泡5min消毒，再用一级水冲洗干净。8质量控制要求8.1内部质控：每批次测定需随样品测定1个已知赋值的pH质控品（优先选用中检院核发的生物制品基质pH质控品），质控品测定值与靶值的偏差≤±0.03pH时，判定该批次测定数据有效；偏差超出范围时，查找原因重新测定。8.2电极性能验证：每月对电极斜率进行验证，25℃下测定pH值相差3个单位的两种标准缓冲液的电动势，计算斜率，斜率为理论值的95%~105%即为合格，斜率低于90%时更换电极。8.3空白验证：每批次测定前测定一级水的pH值，应处于5.0~7.0范围内，超出范围说明实验用水被二氧化碳污染或电极残留污染物，需更换实验用水或清洗电极。8.4标准缓冲液核查：每月对在用的标准缓冲液进行核查，用新配制的标准缓冲液测定待核查缓冲液的pH值，偏差≤±0.02pH时可继续使用，超出范围立即废弃。9异常情况处理9.1读数不稳定可能原因及处理方式：①电极活化不足：将电极置于3mol/L氯化钾溶液中重新活化24h；②液接界堵塞：将电极浸入3mol/L氯化钾溶液中超声清洗5min，仍不通畅时更换电极；③样品温度波动大：将样品置于恒温水浴中平衡至温度稳定后测定；④电极表面吸附蛋白：用中性蛋白酶洗液浸泡15min后冲洗干净。9.2测定值与预期偏差过大可能原因及处理方式：①校准失效：重新校准pH计；②标准缓冲液变质：更换新配制的标准缓冲液；③样品接触空气时间过长，二氧化碳溶解：重新取样测定；④电极选择错误：含氟样品更换耐氟电极，高粘度样品更换大孔液接界电极。9.3电极响应迟缓可能原因及处理方式：①玻璃膜老化：更换电极；②玻璃膜表面有污染物：按污染类型选择对应的清洗液浸泡清洗。10生物安全要求10.1涉及病原微生物的生物制品测定，严格遵守《病原微生物实验室生物安全管理条例》要求，在对应生物安全等级的实验室中操作，不得在开放环境中测定高致病性病原微生物相关样品。10.2测定后的废弃样品、接触过样品的烧杯、枪头、电极清洗废液等，全部放入生物危害废弃物袋中，经121℃高压灭菌20min后按医疗废弃物处理。10.3发生样品溢洒时，立即用0.5%次氯酸钠溶液覆盖消毒30min，按实验室生物安全应急预案处理，及时上报生物安全负责人。10.4活疫苗、菌苗测定时，搅拌速度控制在100r/min以内，避免产生气溶胶，操作完成后开启生物安全柜紫外消毒30min。11结果报告11.1结果计算：平行样测定值符合偏差要求时，取算术平均值作为最终结果，0.01级pH计测定结果保留2位小数，0.001级pH计测定结果保留3位小数；样品经稀释复溶的，备注稀释比例、复溶溶剂。11.2应包含样品名称、批号、规格、生产单位、测定日期、测定温度、校准用标准缓冲液信息、平行样测定值、最终结果、判定依据、测定人、复核人、批准人信息。11.3结果判定：按产品质量标准的pH限值进行判定，测定结果在限值范围内判定为符合规定，超出限值判定为不符合规定。12注意事项12.1温度补偿仅补偿电极的响应斜率偏差，无法补偿样品本身pH随温度的变化，因此产品质量标准明确规定测定温度的，必须严格控制样品温度在规定范围内，不得在其他温度下测定后换算结果。12.2测定含铝佐剂的混悬样品时，需保持低速搅拌，避免佐剂沉降，电极使用后立即用0.1mol/L稀盐酸浸泡10min去除吸附的铝盐，避免堵塞液接界。12.3测定蛋白类样品后，立即用中性蛋白酶洗液浸泡电极15min，避免蛋白凝固在玻璃膜表面影响后续测定。12.4标准缓冲液应单独使用，不得倒回原瓶避免污染，4℃保存的标准缓冲液取出后需平衡至测定温度后再使用