生物制品铬盐测定指南（试行）

生物制品铬盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于预防类生物制品（灭活疫苗、减毒活疫苗、重组疫苗、类毒素等）、治疗类生物制品（单克隆抗体、重组蛋白药物、血液制品、细胞因子、基因治疗产品、细胞治疗产品原辅材料）、体内诊断类生物制品的原料、辅料、中间品、成品及生产过程质控样品中铬盐（总铬、六价铬）的定性定量测定，同时适用于生物制品接触的生产设备组件、过滤系统、内包装材料的铬浸出量测定。非注射给药类生物制品的铬盐测定可参照本指南调整限度要求。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件：《中华人民共和国药典》2025年版三部、四部；ICHQ3D（R1）《元素杂质指导原则》；GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》；GB/T27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》；USP<232>《元素杂质限度》、USP<233>《元素杂质测定方法》。3术语和定义3.1总铬：指样品中所有价态铬元素的总含量，包括三价铬、六价铬及结合态铬。3.2六价铬：指以Cr⁶⁺形态存在的铬化合物，包括铬酸盐、重铬酸盐等，为明确毒性的管控类杂质。3.3全程空白：指不加入待测样品，其余前处理、测定步骤与样品完全一致的试验对照，用于消除器皿、试剂、环境引入的污染干扰。3.4检出限：指特定方法能够定性检出样品中铬的最低浓度，定量限指能够准确定量的最低浓度，二者均通过基质匹配样品重复测定的标准差计算获得。4方法原理4.1电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，仲裁法）：样品经完全消解后，由载气带入等离子体炬，在高温下电离为带电离子，经质量分析器按质荷比分离后检测52Cr的离子计数，离子计数强度与铬浓度成正比，通过标准曲线法定量总铬含量。该方法灵敏度高、抗干扰能力强，适用于所有基质样品的总铬准确定量，作为结果争议时的仲裁方法。4.2石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）：样品消解后注入石墨炉，经干燥、灰化去除基质干扰后，在高温下原子化为铬原子蒸气，对357.9nm的特征共振线产生选择性吸收，吸光度与铬浓度成正比，通过标准曲线法定量总铬含量，适用于大部分基质样品的总铬常规测定。4.3二苯碳酰二肼分光光度法（DPC）：酸性条件下，样品中的六价铬与二苯碳酰二肼发生氧化还原反应，生成紫红色螯合物，在540nm波长处的吸光度与六价铬浓度成正比，通过标准曲线法定量六价铬含量，适用于基质相对简单、六价铬含量高于定量限的样品测定。5试剂与材料除另有说明外，所有试剂均为优级纯及以上纯度，试验用水为符合GB/T6682要求的一级水，所有接触样品的器皿均需经20%（v/v）硝酸浸泡24h以上，用一级水冲洗3次后晾干备用，严禁使用铬酸洗液处理任何试验器皿。5.1硝酸：痕量金属级，经亚沸蒸馏纯化，空白铬含量低于0.01μg/L。5.2过氧化氢：30%，优级纯，空白铬含量低于0.01μg/L。5.3高氯酸：优级纯，空白铬含量低于0.02μg/L。5.4硫酸：优级纯，1+1（v/v）水溶液，用于六价铬测定的pH调节。5.5磷酸：优级纯，1+1（v/v）水溶液，用于消除铁等金属离子的干扰。5.6基体改进剂：10g/L磷酸二氢铵+1g/L硝酸镁混合水溶液，或1g/L硝酸钯水溶液，用于石墨炉法测定时消除基体干扰。5.7二苯碳酰二肼溶液：称取0.2g二苯碳酰二肼溶于100mL丙酮中，转移至棕色试剂瓶4℃避光保存，有效期1个月，溶液颜色变红后禁止使用。5.8铬标准储备液：总铬、六价铬均采用有证标准物质溶液，浓度为1000mg/L，按证书要求储存，有效期参照证书规定。5.9标准使用液：总铬标准使用液用1%硝酸逐级稀释为10μg/L（ICP-MS法）、100μg/L（GFAAS法）；六价铬标准使用液用一级水稀释为1mg/L，现用现配。5.10内标溶液：ICP-MS法采用10μg/L钪（⁴⁵Sc）或铟（¹¹⁵In）溶液，由有证标准物质稀释获得，在线加入。5.11滤膜：0.45μm聚醚砜滤膜，提前验证铬空白值低于方法检出限后方可使用。6仪器与设备所有计量器具均需经法定计量部门检定合格且在有效期内使用。6.1电感耦合等离子体质谱仪：配备碰撞反应池系统，可校正⁴⁰Ar³⁵Cl对⁵²Cr的质谱干扰。6.2石墨炉原子吸收光谱仪：配备铬空心阴极灯、氘灯或塞曼背景校正系统。6.3紫外可见分光光度计：波长范围190-900nm，配备1cm石英比色皿。6.4微波消解系统：配备聚四氟乙烯消解罐，具有控温、控压及安全泄压功能，最高温度≥220℃。6.5电热板：控温范围室温-250℃，温控精度±5℃，无铬涂层。6.6恒温水浴锅：控温范围室温-100℃，温控精度±2℃。6.7分析天平：感量0.1mg，精度等级I级。6.8离心机：最大转速≥10000r/min，配备聚四氟乙烯离心管。7样品采集与保存7.1液体样品：直接采集至高密度聚乙烯瓶中，密封后标注样品信息，2-8℃避光保存，总铬测定7天内完成，六价铬测定24h内完成。含铝佐剂的疫苗样品需充分摇匀后取样，避免佐剂沉降导致取样偏差。7.2固体/冻干样品：无菌条件下按说明书要求复溶后按液体样品处理，或直接称取固体样品消解，采集后密封干燥保存，有效期内完成测定。7.3生产接触材料浸出样品：按药典包材相容性试验要求制备浸出液，浸出介质采用生理氯化钠溶液或产品制剂缓冲液，浸出条件模拟生产或储存极端条件，浸出液按液体样品要求保存测定。7.4取样量：每份样品取样量至少满足3次平行测定需求，液体样品不少于10mL，固体样品不少于2g，痕量样品可适当增大取样量，最大取样量不超过消解罐容积的1/10。8分析步骤8.1ICP-MS法测定总铬8.1.1样品前处理：微波消解法（首选）：准确移取0.5-2mL液体样品或称取0.2-0.5g固体样品置于消解罐中，加入5mL硝酸、2mL过氧化氢，密封后置于微波消解仪中，消解程序为：5min升温至120℃，保持5min；5min升温至160℃，保持10min；5min升温至190℃，保持20min。消解完成后冷却至室温，开罐后置于150℃电热板赶酸至剩余液体0.5-1mL，用1%硝酸转移至25mL容量瓶定容，摇匀待测。含高浓度有机物的重组蛋白、血液制品样品可适当增加过氧化氢用量，延长消解保持时间，确保消解液澄清无残留。湿法消解法（无微波消解设备时使用）：准确移取/称取样品置于三角瓶中，加入10mL硝酸+2mL高氯酸，冷消化过夜，置于160℃电热板加热消解，至冒高氯酸白烟、溶液澄清无色，若溶液仍有棕黄色需补加2mL硝酸继续消解，赶酸至近干后用1%硝酸溶解残渣，定容至25mL。8.1.2标准曲线制备：用1%硝酸配制总铬标准系列，浓度为0、0.1、0.5、1、2、5、10μg/L，在线加入内标溶液后上机测定，以铬浓度为横坐标、离子计数与内标计数的比值为纵坐标绘制标准曲线，要求相关系数≥0.999。8.1.3仪器参数：射频功率1550W，载气流量1.0L/min，辅助气流量0.8L/min，采样深度8mm，碰撞反应池模式，氦气流量4.5mL/min，测定同位素⁵²Cr，内标⁴⁵Sc。8.1.4样品测定：将处理好的样品液、全程空白液上机测定，记录响应值，从标准曲线中获得对应浓度。每10个样品插入1个质控样，质控样测定值需在证书标称值的90%-110%范围内，否则重新绘制标准曲线。8.2GFAAS法测定总铬8.2.1样品前处理：同8.1.1要求。8.2.2标准曲线制备：用1%硝酸配制总铬标准系列，浓度为0、1、2、5、10、20μg/L，分别取20μL标准溶液+5μL基体改进剂注入石墨炉测定，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，要求相关系数≥0.999。8.2.3石墨炉程序：干燥阶段120℃保持30s；灰化阶段1500℃保持20s；原子化阶段2600℃保持5s（停气）；清除阶段2700℃保持3s。波长357.9nm，灯电流6mA，狭缝宽度0.5nm，塞曼背景校正。8.2.4样品测定：取20μL样品液+5μL基体改进剂注入石墨炉测定，记录吸光度，从标准曲线获得对应浓度，每10个样品插入质控样验证。8.3DPC法测定六价铬8.3.1样品前处理：基质简单的液体样品：准确移取5mL样品至50mL比色管中，若样品浑浊，加入0.5mL氢氧化锌共沉淀剂摇匀，静置10min后过滤，弃去初滤液，取中间滤液待测。高蛋白样品：准确移取5mL样品，加入5mL10%三氯乙酸溶液沉淀蛋白，4℃静置30min后4000r/min离心10min，取上清液待测。含还原性物质样品：加入0.5g尿素摇匀，逐滴加入10%亚硝酸钠溶液至溶液无色，过量的亚硝酸钠与尿素反应消除，避免还原六价铬。8.3.2标准曲线制备：分别移取0、0.25、0.5、1、2.5、5、10mL六价铬标准使用液（1mg/L）至50mL比色管中，加水至刻度，加入0.5mL1+1硫酸、0.5mL1+1磷酸摇匀，加入2mL二苯碳酰二肼溶液摇匀，室温避光放置10min，于540nm波长处用1cm石英比色皿测定吸光度，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，相关系数≥0.999。8.3.3样品测定：取处理好的样品液至50mL比色管，加水至刻度，按标准曲线制备步骤加入试剂测定吸光度，全程空白同步测定，若吸光度超过标准曲线上限，需稀释后重新测定。9结果计算9.1总铬含量计算：ρ=(C-C₀)×V×f/m式中：ρ为样品中总铬含量，单位为μg/L（液体样品）或μg/kg（固体样品）；C为样品测定浓度，μg/L；C₀为全程空白浓度，μg/L；V为定容体积，mL；f为稀释倍数；m为取样量，mL（液体）或g（固体）。9.2六价铬含量计算：ρ(Cr⁶⁺)=(C₁-C₀₁)×V₁×f₁/m₁式中：ρ(Cr⁶⁺)为样品中六价铬含量，单位为mg/L或mg/kg；C₁为样品测定浓度，mg/L；C₀₁为全程空白浓度，mg/L；V₁为定容体积，mL；f₁为稀释倍数；m₁为取样量，mL或g。9.3结果表述：测定结果保留2位有效数字，低于检出限时报“未检出”并注明方法检出限，超过定量限的结果需同时报告不确定度。10方法性能指标10.1检出限与定量限：ICP-MS法总铬检出限0.01μg/L，定量限0.05μg/L；GFAAS法总铬检出限0.1μg/L，定量限0.5μg/L；DPC法六价铬检出限0.004mg/L，定量限0.01mg/L。10.2准确度：总铬加标回收率为85%-115%，六价铬加标回收率为80%-120%，基质复杂样品回收率可适当放宽至75%-125%。10.3精密度：平行样测定相对标准偏差（RSD）≤10%，不同实验人员、不同仪器的重现性RSD≤15%。11质量控制要求11.1空白控制：每批次样品至少做2份全程空白，空白值需低于方法检出限，若空白值超标需排查器皿、试剂、环境污染，重新处理样品。11.2平行样控制：每批样品至少做10%的平行样，平行样相对偏差≤15%，超出范围需重新测定。11.3质控样控制：每20个样品至少插入1个有证基质质控样，测定值需在标称值的±20%误差范围内，否则重新校准仪器、绘制标准曲线后重测。11.4器皿控制：每批浸泡后的器皿抽测10%的空白值，确认无铬污染后方可使用。12限度要求12.1注射类生物制品：按ICHQ3D要求，铬的每日允许暴露量（PDE）为11μg/d，根据产品每日最大给药剂量计算限度：单剂给药量≤1mL的疫苗类产品，总铬限度为0.5μg/剂；血液制品每1g蛋白总铬限度为10μg；单克隆抗体、重组蛋白等治疗产品，总铬限度为1μg/日最大给药剂量。六价铬不得检出（低于方法定量限）。12.2原辅材料：氢氧化铝佐剂总铬限度为2μg/g，细胞培养基总铬限度为5μg/L，包材浸出液总铬限度为0.05mg/L。12.3非注射类产品：参照ICHQ3D对应给药途径的PDE值计算限度，皮肤外用类产品总铬PDE为800μg/d，口服类产品总铬PDE为11000μg/d。13注意事项13.1污染防控：铬为环境常见元素，试验过程中严禁接触不锈钢器具，操作需在洁净通风橱中进行，试验人员需佩戴无粉乳胶手套，避免皮肤接触样品。13.2干扰消除：ICP-MS测定时需开启碰撞反应池消除氯的质谱干扰，高盐样品可采用标准加入法定量；GFAAS测定含高盐基质样品时需优化灰化温度，降低背景干扰；六价铬测定时需严格控制pH在1.0-2.5范围内，避免三价