生物制品渗透压测定指南（试行）

生物制品渗透压测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗类、治疗性抗体类、血液制品类、细胞与基因治疗产品类、重组蛋白类生物制品的原液、中间品、成品及生产用辅料的渗透压摩尔浓度测定，同时适用于生物制品研发阶段、生产过程质量控制、放行检验、上市后抽验各环节的渗透压测定工作。对于有特殊基质或特殊测定要求的生物制品，可在本指南基础上补充验证后制定专属操作规程。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版四部通则0632渗透压摩尔浓度测定法《药品生产质量管理规范（2010年修订）》及附录USP<785>OsmolalityandOsmolarityEP2.2.35OsmolalityICHQ2（R1）分析方法验证指导原则3术语和定义3.1渗透压摩尔浓度：指单位质量溶剂中所含溶质颗粒的总物质的量，反映溶液中所有溶质的总颗粒数，单位为Osmol/kg或mOsmol/kg（1Osmol/kg=1000mOsmol/kg）。生物制品领域通常以毫渗透压摩尔浓度（mOsmol/kg）作为报告单位。3.2冰点降低法：基于稀溶液依数性原理，通过测定溶液冰点下降值换算得到渗透压摩尔浓度的方法，是目前生物制品渗透压测定的首选方法。3.3蒸汽压降低法：基于稀溶液依数性原理，通过测定溶液蒸汽压下降值换算得到渗透压摩尔浓度的方法，适用于样品量极少、含挥发性溶质或不宜冷冻的生物制品测定。3.4摩尔冰点下降常数（Kf）：指1mol非电离溶质溶解于1kg溶剂中导致溶剂冰点下降的数值，常压下水的Kf为1.86℃·kg/mol，为渗透压测定的核心换算常数。4基本原理稀溶液的渗透压与溶液中溶质的颗粒数量呈正相关，与溶质的分子量、电荷、形态无关，属于稀溶液依数性的典型表现。当溶液中溶质总颗粒浓度较低时，渗透压、冰点下降值、蒸汽压下降值三者呈线性对应关系，可通过测定其中任意参数换算得到渗透压摩尔浓度。4.1冰点降低法原理：常压下纯水的冰点为0℃，当水中加入溶质后，溶液冰点低于纯水，冰点下降值ΔTf与溶液质量渗透压摩尔浓度m的关系符合公式：ΔTf=Kf×m。其中Kf为水的摩尔冰点下降常数（1.86℃·kg/mol），通过测定样品的冰点下降值即可直接计算得到渗透压摩尔浓度。该方法准确度高、线性范围宽，适用于绝大多数不含挥发性干扰组分的生物制品测定。4.2蒸汽压降低法原理：密闭体系中，溶液的蒸汽压低于纯溶剂的蒸汽压，蒸汽压下降值与溶液中溶质颗粒数呈正相关，通过热敏电阻测定体系达到气液平衡时的温度差，即可换算得到渗透压摩尔浓度。该方法无需冷冻样品，取样量仅需1~10μl，适用于细胞治疗产品、微量珍贵样品的测定，但检测结果易受挥发性溶质（如乙醇、丙酮）干扰，需提前做专属性验证。5仪器设备与耗材5.1仪器类型及技术要求5.1.1冰点渗透压仪：测量范围应覆盖0~3000mOsmol/kg，分辨率≤1mOsmol/kg，测量示值误差≤±2mOsmol/kg，重复性RSD≤1%。仪器应具备自动过冷触发、自动结晶、结果自动换算功能，需定期经计量部门检定合格，检定周期不超过1年。5.1.2蒸汽压渗透压仪：测量范围应覆盖0~3000mOsmol/kg，分辨率≤2mOsmol/kg，测量示值误差≤±3mOsmol/kg，重复性RSD≤2%。仪器应具备温度自动控制、气液平衡自动判定功能，检定周期同冰点渗透压仪。5.2校准品应采用经国家计量部门溯源的渗透压校准品，优先选用氯化钠标准溶液，校准品的不确定度应≤1%。不同渗透压摩尔浓度对应的氯化钠标准溶液配制要求见附录A。校准品应按照说明书要求储存，避免污染，超过有效期的校准品不得使用。5.3耗材5.3.1样品管：应采用与样品无相互作用、无溶质析出的一次性聚丙烯样品管，尺寸符合仪器要求，使用前需确认无颗粒、无残留杂质。5.3.2移液器：应根据样品量选择相应量程的移液器，最大允许误差≤±0.5%，定期校准，校准周期不超过6个月。5.3.3实验用水：应符合《中华人民共和国药典》2025年版四部纯化水要求，渗透压≤10mOsmol/kg，用于零点校准及校准品配制。6人员要求6.1操作人员应经过渗透压测定相关理论及操作培训，掌握仪器原理、操作流程、校准方法、偏差处理及生物安全防护要求，考核合格后方可上岗。6.2从事感染性、毒性生物制品测定的人员，应经过对应生物安全等级的操作培训，熟悉样品灭活、废弃物处置流程。7样品管理7.1采样要求：采样应具备代表性，按照GMP要求的无菌采样规程操作，避免样品被污染、稀释或发生溶质降解、析出。采样量应满足平行测定、复测及留样需求，一般不少于200μl。7.2储存与运输：样品应严格按照产品说明书规定的条件储存与运输，需冷冻保存的样品应避免反复冻融，2~8℃保存的样品应避免结冰。样品测定前应平衡至室温（20~25℃），混匀后去除气泡。7.3前处理要求：7.3.1含不溶性佐剂、颗粒的样品（如铝佐剂疫苗、混悬型制剂），应按照产品质量标准要求处理，无明确规定的，应在4℃条件下以12000r/min离心5分钟，取上清液测定，避免不溶性颗粒干扰冰点结晶过程。7.3.2粘稠度较高的样品（如浓度≥100mg/ml的单克隆抗体、25%人血白蛋白），取样时应确保量取准确，若需稀释测定，应提前完成稀释线性验证，确认稀释倍数与渗透压值呈线性相关，稀释液应选用与样品基质一致的空白缓冲液。7.3.3含气泡的样品，应在3000r/min条件下离心1分钟去除气泡后测定，避免气泡导致的测定偏差。7.3.4感染性样品如需灭活后测定，应验证灭活工艺不改变样品的渗透压值。8测定操作流程8.1冰点降低法操作流程8.1.1开机预热：开启仪器及配套软件，按照仪器说明书要求预热，一般不少于30分钟，待仪器制冷模块、温度传感器达到稳定状态后方可操作。8.1.2仪器校准：（1）零点校准：取纯化水加入样品管，放入仪器测量位进行零点测定，测定值应≤10mOsmol/kg，若超出范围应更换纯化水重新校准，排查仪器污染情况。（2）两点校准：根据待测样品的渗透压范围选择两个校准点，校准点应分别覆盖待测值的上下20%范围。例如等渗注射剂样品可选择300mOsmol/kg、1000mOsmol/kg校准品，高渗制剂可选择1000mOsmol/kg、2000mOsmol/kg校准品。校准品的测定值与标示值的偏差应≤±2mOsmol/kg，若超出偏差范围应重新校准，必要时排查仪器故障。（3）校准频率：每次开机、连续使用超过8小时、更换校准品批次、仪器搬动或维修后，均需重新进行校准。8.1.3样品测定：（1）取10~100μl（根据仪器要求确定）处理后的样品加入样品管，避免产生气泡，将样品管放入仪器测量位，启动测定程序。（2）仪器自动降温至过冷状态（通常为-7℃左右），触发结晶后测定冰点，自动换算为渗透压摩尔浓度。（3）每个样品至少平行测定2次，两次测定值的相对偏差≤2%时，取平均值作为测定结果；若相对偏差超过2%，应重新取样测定，排查样品不均一、污染、含气泡等原因。8.1.4测定后处理：取出样品管按照废弃物管理要求处置，清理仪器测量位，关闭仪器及软件。8.2蒸汽压降低法操作流程8.2.1开机预热：开启仪器，预热不少于60分钟，待样品室温度稳定在37℃（或设定温度）后进行操作。8.2.2校准：采用与待测样品渗透压范围接近的校准品进行两点校准，校准偏差≤±3mOsmol/kg为合格。8.2.3样品测定：取1~10μl样品滴加在样品盘上，避免产生气泡，放入样品室后关闭舱门，待气液平衡后仪器自动测定并换算结果，平行样要求同冰点降低法。8.2.4注意事项：含挥发性组分的样品不得采用蒸汽压法测定，避免干扰蒸汽压测定值。9质量控制要求9.1随行质控：每批次样品测定时应同步测定渗透压质控品，质控品的渗透压值应覆盖待测样品的范围，质控测定值与标示值的偏差应≤±3%，若超出范围应停止测定，排查校准偏差、仪器故障、污染等问题，重新校准合格后方可继续测定。9.2超标结果（OOS）处理：若样品测定结果超出质量标准范围，应立即启动OOS调查：（1）第一时间复测同一样品，确认是否为操作误差、仪器偏差导致的结果异常；（2）若复测结果仍超标，重新取同批次留样样品测定，排除采样偏差、样品不均一的影响；（3）若复测结果仍超标，按照GMP要求启动全面OOS调查，记录调查过程及结论，不得随意修改测定数据。9.3数据完整性要求：所有测定数据（包括校准记录、质控记录、样品测定记录、偏差调查记录）应可追溯，电子数据应定期备份，不可篡改，记录保存期限符合GMP要求，即至少保存至产品有效期后1年，无有效期的产品保存至少5年。10不同类型生物制品测定注意事项10.1疫苗类产品：（1）含铝佐剂、油佐剂的灭活疫苗、重组亚单位疫苗，需离心去除佐剂后取上清测定，避免佐剂颗粒导致的结晶触发异常、结果偏差；（2）mRNA疫苗、含脂质纳米粒（LNP）的疫苗，测定前应平衡至室温，避免低温导致LNP破裂、内容物释放，影响测定结果，不得反复冻融样品；（3）减毒活疫苗测定时应做好生物安全防护，测定后对仪器接触部位进行消毒，避免交叉污染。10.2治疗性抗体类产品：（1）高浓度抗体（≥100mg/ml）粘稠度高，取样时应慢吸慢放，确保取样量准确，稀释测定时应验证稀释倍数与结果的线性关系，验证范围覆盖最大稀释倍数；（2）含吐温80、聚山梨酯等表面活性剂的样品，应验证表面活性剂不影响测定结果，高浓度表面活性剂可能导致冰点降低异常，需调整测定参数。10.3血液制品类产品：（1）高渗血液制品（如25%人血白蛋白、静注免疫球蛋白）渗透压通常在1000~1500mOsmol/kg范围内，应选择对应的校准范围，避免超出仪器线性区间；（2）冷沉淀、凝血因子类产品应完全溶解后测定，避免蛋白沉淀导致的结果偏低。10.4细胞与基因治疗产品：（1）CAR-T细胞、NK细胞等细胞注射液样品量少，优先采用蒸汽压渗透压仪测定，取样时避免混入细胞团块，离心取上清液测定；（2）溶瘤病毒、AAV载体等基因治疗产品，应在生物安全柜内操作，测定后样品及耗材高压灭菌处置，仪器采用0.1%次氯酸钠溶液消毒。10.5辅料与中间品：（1）高浓度盐溶液、蔗糖/海藻糖等冻干保护剂溶液渗透压较高，超出线性范围时应经稀释验证后稀释测定，结果乘以稀释倍数；（2）缓冲液类中间品测定值应与理论渗透压值偏差≤±5%，若超出范围应排查缓冲液配制误差。11方法学验证要求新开发的生物制品渗透压测定方法需按照ICHQ2（R1）及中国药典分析方法验证要求完成验证，验证内容包括：11.1专属性：测定空白基质（不含活性成分的辅料溶液）、含活性成分的样品、加标样品，确认基质组分、活性成分不干扰测定结果，空白基质测定值与理论值偏差≤±3%。11.2线性：配制5个不同浓度的样品溶液，浓度范围覆盖质量标准限度的±20%，测定结果的线性相关系数r≥0.99，斜率与理论值偏差≤±5%。11.3精密度：（1）重复性：同一操作人员同一天测定6份平行样品，测定结果的RSD≤2%；（2）中间精密度：2名不同操作人员在不同日期分别测定6份平行样品，总RSD≤3%。11.4准确度：采用加样回收法，向样品中加入低、中、高三个浓度的标准溶质，每个浓度平行测定3份，回收率应在98%~102%范围内。11.5耐用性：考察不同样品量（±20%）、不同测定温度（±2℃）、不同校准品批次对测定结果的影响，各条件下的测定结果偏差≤±3%。11.6定量限：定量限对应的渗透压值应低于质量标准下限的20%，定量限处的测定精密度RSD≤5%。12生物安全与废弃物处理12.1生物安全防护：操作感染性、毒性生物制品时，应在对应生物安全等级的生物安全柜内进行，操作人员穿戴防护服、手套、口罩、护目镜，避免样品接触皮肤、黏膜。12.2废弃物处置：测定后的一次性样品管、枪头、残留样品应分类处置：感染性废弃物放入高压灭菌袋，121℃高压灭菌30分钟后按照医疗废弃物处置；含毒性成分的废弃物按照危险化学品处置要求移交有资质的机构处理；普通无危害样品按照一般实验废弃物处置。12.3仪器消毒：测定过感染性、毒性样品的仪器，应对测量位、样品接触部位采用75%乙醇或0.1%次氯酸钠溶液擦拭消毒，避免交叉污染。13异常情况处理13.1结晶触发失败：冰点法测定时仪器提示过冷未结晶，应排查原因：样品量不足、样品含不溶性颗粒、制冷模块温度异常，处理方式为重新取样，确保样品量符合要求，必要时加入微量冰粒作为晶种，验证晶种不影响测定结果后再次测定。13.2平行样偏差过大：排查原因：样品不均一、取样不准确、样品含气泡、仪器温度不稳定，处理方式为重新混匀样品，离心去除气泡，校准移液器后重新测定。13.3结果超出线性范围：测定值高于仪器上限时，采用经过验证的稀释倍数稀释样品后测定，结果乘以稀释倍数；测定值低于仪器下限时，排查是否为样品被冷凝水稀释、纯化水残留污染，重新取样测定。14记录与报告要求14.1记录内容：应包括样品名称、批号、规格、生产企业、采样日期、测定日期、仪器型号及编号、校准品批号及校准结果、质控品测定结果、