CN119464373A 一种大种粒、高油型甘蓝型油菜的育种方法 （西北农林科技大学）

时敲除BnaWIP2基因的6个拷贝，获得具有大种粒、高油的甘蓝型油菜CRISPR/Cas9基因编辑材2所述BnaWIP2基因包括BnaA04.WIP2基因、BnaA07.WIP2基因、BnaA09.WIP2基因、2.根据权利要求1所述的大种粒、高油型甘蓝型油菜的育种方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除甘蓝型油菜中的B步骤一，构建BnaWIP2基因CRISPR/Cas9表达载体和含有BnaWIP2基步骤二，基于农杆菌介导的方法遗传转化甘蓝型3[0001]本发明属于植物基因工程和生物技术领域，涉及甘蓝型油菜BnaWIP2基因定点突.2023,基于进口视角的我国主要植物油料油脂产业安全研究.中国油料作物学报,45(4):养代谢中发挥重要作用(HanG.,LiY.,QianZ.,etal.,2021,AdvancesintheregulationofepidermalcelldevelopmentbyC2H2Zincfingerproteinsin(CrawfordB.C.W.,DittaG.,YanofskyM.F.2007,TheNTTgeneisrequiredfortransmitting_tractdevelopmentincarpelsofArabidopsisthaliana.CurrentBiology,17(13):1101_1108；Marsch_MartínezN.,ziiiga_MayoV.M.,HerH.,etal.,2014,TheNTTtranscriptionfactorpromotesreplumdevelopmentin达AtWIP2均会抑制角果的开裂(ChungK.S.,LeeJ.H.,LeeJ.S.etal.,2013,FruitindehiscencecausedbyenhancedexpressionofNOTRANSMITTINGTRACTin因的表达，从而决定植株的生殖能力(Herrera_UbaldoH.,Lozano_SotomayorP.,EzquerI.etal.,2019,NewrolesofNOTRANSMITTINGTRACTandSEEDSTICKduringmedial4究发现AtWIP2与AtWIP4、AtWIP5冗余介导生长素信号调控拟南芥根尖分生组织的起始stemcellfatewithinrootandembryonicm拷贝之间往往存在基因冗余现象和基因加性效应(Schranz,M.E.,Lysak,M.A.,Mitchell_Olds,T.etal.,2006,TheABC'sofcomparativegenomicsintheBrassicaceae:NO.2所示，BnaA09.WIP2基因序列如SIQIDNO.3所示，BnaC04.WIP2基因序NO.4所示，BnaC06.WIP2基因序列如SIQIDNO.5所示，BnaC08.WIP2基因序列[0010]可选的方案是，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除甘蓝型油菜中的BnaWIP2基[0014]可选的方案是，上述步骤一中BnaWIP2基因的sgRNA序列sgR_BnaWIP2为5’_ATTGCAGGACAAGAGAACTGAGTA_3’；sgR_BnaWIP2的下游引物sgR_BnaWIP2_R：5’_[0016]图1为BnaWIP2_Cas9基因编辑材料鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果。Const代表5[0017]图2为BnaWIP2基因及实施例的相关BnaWIP2纯合突变体测序结果；其中，图2A为BnaWIP2基因的6个拷贝CRISPR/Cas9靶[0018]图2B为BnaWIP2纯合突变体BnaWIP2_Cas9#4株系在靶标位点区域的测序结果；图2C为BnaWIP2纯合突变体BnaWIP2_Cas9#5株突变体BnaWIP2_Cas9#4及BnaWIP2_Cas9#5株系的成熟种子照片；图3B为甘蓝型油菜品种Westar(野生型)与BnaWIP2突变体BnaWIP2_Cas9#4及BnaWIP2_Cas9#5株系的种子质量的柱状统计图；图3C为甘蓝型油菜品种Westar(野生型)与BnaWIP2突变体BnaWIP2_Cas9#4及BnaWIP2_Cas9#5株系的种子总脂肪酸含量的柱状统计图；图3D为甘蓝型油菜品种Westar(野生型)与BnaWIP2突变体BnaWIP2_Cas9#4及BnaWIP2_Cas9#5株系的种子脂肪酸各组分含[0021]以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施[0023]为了解析甘蓝型油菜BnaWIP2基因对种子发育和种子油脂积累的影响，本实施例利用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除甘蓝型油菜BnaWIP2基因的6个拷贝[0024]CRISPR/Cas9是由RNA引导Cas9蛋白核酸酶在特定的位点对于靶基因进行切割的到了多个AtWIP2的同源基因，根据染色体定位的不同，分别命名为BnaA04.WIP2、Westar中BnaWIP2基因6个拷贝的全长编码区核酸序列如SIQIDNO.1～6[0028]针对甘蓝型油菜品种Westar中BnaWIP2基因6个拷贝的结构和同源关系，基于CRISPRdirect网站(http://crispr.dbcls.jp/)在BnaWIP2基因的第一个外显子上设计了16ATTGCAGGACAAGAGAACTGAATCACGATGACCATGACCAAGGAAACTTAGTGAGCAAA的接头引物稀释到10μM，每对引物分别取10μL混合加入PCR管中95℃保温5min，合成双链[0036]用AarI限制性内切酶将CRISPR/Cas9质粒在37℃恒温培养箱中酶切10小时，酶切[0039]酶切反应结束后，酶切产物按照OMEGA胶回收试剂盒进行纯化后，使用NanoDrop722[0043]将上述T4连接产物加入大肠杆菌感受态细胞DH5α,轻轻吸打混匀放置于冰上22[0049]PCR反应结束后将产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行验证。将PCR检测条带大小正确的菌落选取3个分别加到含有100ug/ml壮观霉素的LB液体培养基中，吸打混匀之后放置于37℃/220rpm摇床过夜培养，挑选单克隆菌液送至上海生工生物工程股份有限公司进BnaWIP2的CRISPR/Cas9[0051]将上述成功构建的BnaWIP2CRISPR/Cas9基因编辑载体吸取5μL加入农杆菌感受8℃摇床振荡培养2小时后将菌液涂布于含100ug/ml壮观霉素和25ug/ml利福平的LB固体培[0052]将PCR检测的阳性菌落挑取3个分别加到含有100ug/ml壮观霉素和25ug/ml利福平液保存在33％的甘油中放置于_80℃进行保存。[0054]对上述构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体基于植物组织培养结合农杆菌介导的遗后将已活化的包含BnaWIP2CRISPR/Cas9基因编辑载体的农杆菌接种到农杆菌悬浮液中，PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳来判断阳性苗。使用表1所示的引物Cas9_F和BnaWIP2_[0056]以BnaWIP2_Cas9#4～#5株系的基因组DNA为模板，以表1所示的BnaX.WIP2_海生工生物工程股份有限公司进行测序，以检测每个CRISPR/Cas9基因编辑突变体中各[0057]BnaWIP2_Cas9#4株系的测序结果如图2B所示，6个拷贝的编辑的位点均在第一个[0058]BnaWIP2_Cas9#5株系的测序结果如图2C所示，6个拷贝的编辑的位点均在第一个[0059]实施例3：验证甘蓝型油菜BnaWIP2_Cas9#4和BnaWIP2_Cas9#5突变体对种子发育9浴锅中水浴2h进行酯化反应。酯化反应结束后，取出玻璃试管并冷却至室温，加入2mL相色谱仪分析各脂肪酸组分。GC_2010plus气相色谱仪配备的色谱柱(Supelcowax_10,Cat.No.24079,Supelco)参数为30m(length)x0.25mm(internaldiameter)x0.5μm[0061]将BnaWIP2_Cas9#4和BnaWIP2_Cas9#5自交培养至纯合后，比较甘蓝型油菜品种Westar(野生型)与BnaWIP2突变体BnaWIP2_Cas9#4及BnaWIP2_Cas9#5株系的种子发育情图3B)。进一步比较甘蓝型油菜品种Westar(野生型)与BnaWIP2突变体BnaWIP2_Cas9#4及