（正式版）DB13∕T 2598-2017 《花生品种真实性与纯度鉴定 SSR法》

DB13/T2598—2017花生品种真实性与纯度鉴定2017-12-22实施2017-12-22实施IDB13/T2598—2017本标准按照GB/T1.1-2009给出的本标准由河北农业大学提出。本标准主要起草人：杨鑫雷、刘立峰、崔顺立、郭丽果、陈焕英、穆国俊、李洪珍。DB13/T2598—2017作程序、数据分析和判定规则。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。3术语和定义品种真实性(VarietalGenuineness)供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。品种纯度(VarietalPurity)品种在特征特性方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表基因组中以几个核苷酸(一般为2个~6个)为重复单元的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列，又称微卫星标记。注：模板DNA经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜温度下，两条引物分别与DNA模板两条链上的一段互补序列发生退火，并在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP(deoxy-ribonucleosidetriphosphate,脱氧核苷三磷酸)为底物，使退火引物延伸从而合成DNA。如此变性退火和合成DNA反复循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。工2DB13/T2598—20175试剂或材料5.7酸酚(acidphenolpH4.3)。5.9Tris饱和酚(pH8.0)。5.10三氯甲烷：分子式为CHCl₃,CAS67-66-3。5.13二水柠檬酸钠：分子式为C₆H₉Na₃Og,CAS6132-04-3。DB13/T2598—201735.17氯化钠：分子式为NaC1,CAS7647-14-5。4℃贮存。称取15gSDS至于烧杯中，加入800mL的去离子水。68℃加热溶解，加浓盐酸调节pH值至7.5,定5.360.5mol/LEDTA溶液DB13/T2598—201745.37溶液I称取20gPVP溶于500mL去离子水中，然后加入100mL1mol/LTris-HCl,100mL0.5mol/LEDTA,100mL15%SDS,37.5mLLiCl,15mLβ一巯基乙醇(用时现加),定容至1L,4℃贮存。5.38氯仿：异戊醇体积比为24:1。5.39酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1。5.40溶液Ⅱ称取236.32g硫氰酸胍，147.05g二水柠檬酸钠，115.62g乙酸铵，10g十二烷基肌氨酸钠溶于800mL去离子水中，加乙酸调节pH值至5.2,定容至1L,4℃贮存。称取EDTA0.88g、溴酚兰0.05g、二甲苯氰FF0.05g于烧杯中，然后加入40mL去离子水，加热搅拌至充分溶解，再加入36mL丙三醇，加2mol/LNaOH调pH值至7.0,定容至100mL,4℃贮存。称取290g丙烯酰胺、410g甲叉双丙烯酰胺于烧杯中，然后加入600mL去离子水，室温充分溶解，加去离子水定溶至1L,过滤，4℃贮存。5.4510%过硫酸铵溶液10%(g/mL)过硫酸铵。4℃贮存。5.471%硫代硫酸钠其中含10%(体积比)无水乙醇和0.5%(体积比)冰乙酸，既用即配。5.49染色液其中含1.5%(g/ml)NaOH和0.4%(体积比)甲醛，即用即配。DB13/T2598—201756.1PCR扩增仪：96孔，0.2mL。6.6高压灭菌锅：120℃±2℃。6.7电子天平：精确度0.001g。6.8恒温水浴锅：温控精确度±1℃。6.9脱色摇床：圆周振荡。6.10磁力搅拌器。6.11微波炉。7样品受检样品种子重量为1000g,随机选取大小均一、健康饱满的种子100粒，重复3次，按GB/T3543.4-1995进行发芽试验，其余种子置于塑封袋中常温或4℃保存。8.1PCR反应及程序DB13/T2598—20176PCR反应及程序见附录C。随机选择不少于100粒受检样品的种子，由核心引物中选取10对引物对受检样品进行电泳，依据电泳谱带的特征和一致性，计数供检样品总数和非本品种特异谱带粒数，并按下列公式计算电泳测定值 (品种纯度)P。及程序见附录C,PCR产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(见附录D)检测。其次，根据受检样品与标准对照混样样本DNA电泳谱带的异同，判定受检样品的真实性，若在所检测的57对核心标记中：b)受检样品与标准对照样本差异标记数=1或2,判读为近似品种；c)受检样品与标准对照样本差异标记数=0,判读为相同或极近似品种。10试验报告(见附录E)DB13/T2598—20177(资料性附录)表A.1SSR标记信息编号标记名称上游引物下游引物1AHGS1357ATGGAGAATAACCAATGGCGATCAAAGCGGAACACACACA2AHS1661CAAAACTTCGAGCTCTTGCCCTCAGTTGCAGGCTAATGACA3Seq3A08ATACGTGACTTGGGCCAGACAGTGAAAAATACACCCAACGAA4TC42A05GAACATGAAGGGACACACACATAGAGAAGCTGGTTGGGTTGTAA5AHGS1171CAAACAGCTCGTCGATTGAAACGGGCTAACCCGATTAGAT6AHGS1197CAAACAAAGCCCAAAGGAAATGGACATTGCTTTTCTTGATTG7AHGS1214GCTTCATTGAGATTGGGGAACAGTTCTCAATAACAGAACCAGC8AHGS1241GCTAAGCTAAATTACCCATTTTGTGGTTTGAGCTTGTGCAGTGGA9AHGS1251GGATTCGGTGAAACGACACTGATGCCCTTTCTTCATCCAAAHGS1278GGAGCAGAATTCAGTTCATTTACAACTGGAGCCTATTCTTCGCAAHGS1286CCCTCCAATCTTCTTCCCTCTTCAACCTCTTCGCTCTACCAAHGS1329CACATTAGTGAGTTTTTCCCCCAAAGGCTAATTGTTTAATTTTACTGCAHGS1342CTGCATAGTGGCGGTGATAACATCGGATTAATTCAACGGTAHGS1382TTCCTGTGCCTTTTGGATTCCGAGATGAAGGTGGTGAGGTAHGS1385TCCCTTTGCTTGTTACCACAAATTTTGAAAGCGGGCATAAAHGS1394CGCCCAGGCTTATAGTGAAGATCCTCACCCCGAGTCTTCTAHGS1510CCAGCCATAACCAACATCCTCAGCATGGATGACGTAGTGGAHGS1573TTCTTGGTTGAAATGACCCCGCTTACCACAGGTAAACCATCCAHGS1594CCGGCAGAACACTCTCTCTCGCGAGATAACTGCATCAGCAAHGS1684ATGGCAATGACAAGACACGACGATGGTAACGAGCCCTAAAAHGS1692CCAAAACAAAGCAAAGGGAAATCCCAACGAGACCACTCAGAHGS1754AAGTTGTTTGGAAAACCCCCCGATTTGTTCTTGCATGTGGAHGS1790GGACGATAGCAACATCAGCAGGGCTAAATTCAAACGCAAAAHGS1886TTCCTTTGAGCCTTTGCACTTGCTAATGAGGATCCATTGCTAHGS1940AACTCCGCGCCTATGTTCTAGGGAGAGGATGATGGTGGTAAHGS1969CCACTGTTTCGTTCCCTCATGATTCAAACGAAACCGCATTAHGS2108AGCACTAGCCGAGTCCATGTCGTCGGATTTACTGACGGATAHGS2782ATGCGGAACTCCACAATTTCTGACGTCGAGTTCATCAAGCAhM086GTGAAATTCTTCCCCGCATATGCCTGTTGCCTACAGAAGAAHS0049TGCTTCTTCTCTCTGTCGCAGCCAGAACTGAGGGTGGATAAHS0941CATTGGAAGCAAATCAGCAACACCCTAATTCCCCCAAGTTAHS1480TGGGCTCCAACAATACAACATGTGTACAGGCATCATCGGTDB13/T2598—20178表A.1SSR标记信息(续)编号标记名称上游引物下游引物EE16ATGGGACCACGAACATTTGAGAGCACGTTCAAGCACTCATTSeq14H06GCAACTAGGGTGTATGCCGTCAACCCTATACACCGAGGGAGM2259GGAAGCACCGATAGTTCCTCTTTCTGCTGCTTTCACTCATCAGM2388GTGAGGAGCATCTTGTGTGGTGAACTTCTTGCAAGGGAACAAseq3B5CCTCCCTGCTTGATCCAATAAACTGTAGCGAATGTGTTACATGGGM1867GAGCAGACATGGTTGAATGGTCACCTCAACGAAGAACTCAGCGM1135ACCAGGAAACCCACCAGTTAGCAACCCAAGTTTTGAACCTCAGM1907CACTGTCCTCTTCCCTCACTCTGGTGGACGAAGAAGAAGAAGAAGM1641ACACGTGTCCCTCAAACACAGTTGCAGAGCTCATCAAGCAGM2536AGCCTCCACCTTCTCCTATTGGATGCAGTGGAGGGATAACAAGM1573GAGACCGGAGACGGAGAGTATACGCCCATAGATTAACCCAGTGM625CCTCACTTCTTTTTGCATGGTTGGAAAGGAAATGATTTGGTGGM2536AGCCTCCACCTTCTCCTATTGGATGCAGTGGAGGGATAACAAAHGS1127CGTCGGAAATATCCGTCTGTCTGCACTCATCCCCTTCATTAHGS1296GAGGTATGGCGTCGTTTGATGTGTTGCAAACACCTCCCTTAHGS1692CCAAAACAAAGCAAAGGGAAATCCCAACGAGACCACTCAGpPGPseq7G2ACTCCCGATGCACTTGAAATAACCTCTGTGCACTGTCCCTPM375CGGCAACAGTTTTGATGGTTGAAAAATATGCCGCCGTTGGM1890CTCTCCGATTATAGGCCAACCTGGCTTCTCCGTGAAAATAACGM1954GAGGAGTGTGAGGTTCTGACGTGGTTCATTGCATTTGCATACGM635TTGTGCGAAGGGTAAGATAGAAATCCTGTGCTTGAATCTGGAATGM1996CATCCCATCATTTTCCCTCTTTACAGTGAAGGTGGGATCCTGGM660TGAAAGTAACTCGTTTACAGTTTGAAGTCACTAAACATGTGGGTAACTAAGAAAGM694ATTTGTGCCCTACCACCTTCTTCCCTCCTAGAGGTTGACTTGAGM2067TCGCCAAGAAGAACAAAACACCTGGTCGAAGAAGGGTTCTCT注：57对核心引物序列信息DB13/T2598—20179B.1取干花生种子1g～1.2g,去种皮，放入研钵中，加液氮研磨至粉末状，转入40mL离心管中。B.2加入10mL溶液I(见5.37),充分混匀。B.3加入5mLpH4.3的酸酚(见5.7)充分混匀5min。B.4加入5mL氯仿：异戊醇(见5.38),混匀5min。B.512000g,4℃~10℃,离心10min,吸取上清9mL,转移到含有9mLpH5.2溶液II(见5.40)B.6加4.5mL酚：氯仿：异戊醇(见5.39),充分混匀5min。B.712000g,离心10min,吸取16mL上清，置于40mL离心管内。B.912000g,离心15min,弃上清，沉淀用2mL冰70%乙醇洗涤，过夜干燥。B.10加入4mL超纯水溶解，再加入4mL4MLiCl,混匀，冰浴1h。B.1112000g,4℃,离心15min。B.12取8mL上清转移到40mL离心管中，加入8mL异丙醇，混匀，12000g,4℃,离心15min。B.14利用紫外分光光度计(见6.15)测定DNA浓度。取提取的DNA溶液5μL,加水995μL,放人比色杯中，用紫外分光光度计检测，记下260nm和280nm下的OD值，计算出DNA的浓度以及最好在1.7～1.8左右。DB13/T2598—2017(规范性附录)反应组分原浓度终浓度体积(μL)10×PCR缓冲液0.2mmol/LTaq酶上游引物0.5mol/L下游引物0.5mol/L受检样品DNA超纯水(DNAfree)--C.2PCR扩增反应程序起始94℃变性5min;55℃复性35个循环(94℃1min,55℃30s,72℃45s);72℃延伸10min;4℃保存。DB13/T2598—2017(规范性附录)D.2凝胶制备玻璃板安装：将玻璃板平放在调平的架子上，再用75%的酒精擦拭玻璃板2次～3次，最后将擦好凝胶配制：量取25.1mLddH₂O,10×TBE4mL,30%丙烯酰胺凝胶原液10