【《达托霉素综述》6800字】

达托霉素综述1.1脂肽类抗生素传染病给国际公共卫生带来沉重负担，并常常造成毁灭性后果。随着病原体对常规抗生素的耐药性强度正在以前所未有的方式上升，严重影响到了公共卫生。为由多重耐药菌引起的感染提供有效的治疗选择，优选具有新颖的作用方式或新颖的药物类别，从而开发出新型创新的抗生素迫在眉睫。含有一个或多个酯键以及酰胺键的天然环状脂肽已成为开发新抗生素的有前途的候选者。这些天然产品中的一些已经上市或处于临床开发的高级阶段。脂肽已被证明可以有效抑制弹性病原体菌株[17]。脂肽是由多种细菌，真菌和酵母产生的微生物表面活性化合物。一直以来，人们研究发掘出很多种结构不同的脂肽类抗生素，它们具有多种多样的生物学活性，如抗菌、抗肿瘤和抗病毒等等，在生物制药和临床应用领域具有良好的应用前景和广阔的发展潜力。20世纪60年代末，Arima等人最先在对枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的研究中发现脂肽类抗生素。Chen[18]等人把解淀粉芽孢杆菌从深海沉积物中分离出来后发现，它生成了两种新型脂肽，证明了芽胞杆菌属(Bacillus)和类芽胞杆菌属(Paenibacillus)的细菌产生脂肽类抗生素这一结论。随后，一系列研究发现脂肽类抗生素也可由其他微生物通过代谢而产生。如Vilela[19]等人研究海洋细菌黄腐双歧杆菌（Brevibacteriumluteolum）产生生物表面活性剂，结构表征表明该生物表面活性剂具有脂肽性质。Sharafi[20]等人发现嗜热嗜热气单胞菌MK01（AneurinibacillusthermoaerophilusMK01）是生产生物表面活性剂的最有效候选者，且MK01生物表面活性剂的初步表征表明脂肽结构。1.1.1脂肽类抗生素的结构20世纪50年代，随着安霉素（Amphomycin）和其各种紧密相关的脂肽的分离，脂肽类抗生素这一新型抗生素进入人们视野，但由于当时技术有限，安霉素一直被认为具有线性结构[21]。到后来研究阐明多组分化合物A21978C的结构，脂肽类抗生素的环状性质才变得清晰明了。脂肽类抗生素是由大型基因簇编码的非核糖体肽合成酶复合物合成的次级代谢产物。每个脂肽结构通常包含亲水性肽和疏水性的脂肪酰基侧链，有些还包含非蛋白质氨基酸或其他异常成分。基于肽链的拓扑结构，脂肽可以是环状的或线性的[22]，但研究较多的还是环状类脂肽抗生素，如玫瑰孢链霉菌NRRL11379（StreptomycesroseosporusNRRL11379）生产的A21978C，弗氏链霉菌（Streptomycesfradiae）生产的A54145和天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor）生产的钙依赖性抗生素（CDA）等等。对于环脂肽类抗生素而言，它最显著的特征为分子结构呈现环状[23]。其中，环状十肽由氨基酸和非蛋白质源氨基酸(如:Orn，OmAsp和3mGlu等)以酰胺键或酯键的形式组成肽环或羧酸肽环[24]，几种常见的化合物结构见下图1.2。不难发现，这几种化合物不仅拥有完全相同的环状脂肽结构，在其十肽环的相同位置上都包含一样或者类似的氨基酸残基。比如:十肽A21978C，A54145和CDA，在它们的等效环位置上都包含Thr、3mGlu或Glu。不同结构的环脂肽抗生素表现出的作用方式可能存在细微差异，但正是由于其结构上呈现出来的相似性，导致环脂肽类抗生素具有相同或相似的生物活性，即都对革兰氏阳性菌具有一定程度的抗菌活性。图1.2常见的环脂肽类抗生素结构[24]Figure1.2Thestructureofcommoncycliclipopeptideantibiotics[24]环脂肽抗生素在多数情况下呈现酸性性质，在pH=7的条件下，它们又携带负电荷，这一特征促成了它的高水溶性特征；同时，结构中存在脂质尾链以及某些疏水性氨基酸残基，使其又表现出良好的脂溶性，更加轻易和细菌的磷脂层发生反应。这就导致整体表现出两亲性特征[23]。事实证明，环脂肽类抗生素的两亲性性质不仅对化合物的分离纯化至关重要，也为反相HPLC和阴离子交换色谱方法的使用提供了理论支撑。1.1.2环脂肽类抗生素的抗菌活性环脂肽类抗生素对革兰氏阳性菌表现出良好的抗菌活性，而对革兰氏阴性菌没有活性。从不同程度来说，其抗菌活性都是依赖于溶液中钙离子的浓度[23]。A54145对葡萄球菌，链球菌，梭菌和肠球菌都具有抗菌活性，具有3mGlu12的化合物通常比具有Glu12的化合物更有效和更具毒性，并且具有较长酰基侧链的化合物比具有较短侧链的化合物活性更高[24]。当溶液中没有Ca2+的情况下，达托霉素和A54145表现出微乎其微的抗菌活性。只有当Ca2+浓度为1.25mmo1/L时，达托霉素和A54145的抗菌活性才会呈现最佳状态[25]。当Ca2+浓度为16mmo1/L时，CDA也呈现出最佳抗菌活性。许多研究表明，肽链的两亲性结构和疏水性阈值对于环脂肽类抗生素生物学功能至关重要。通过研究环脂肽类抗生素A21978C、A54145、安霉素和天冬霉素（laspartomycin）发现，其N端脂肪酸侧链的长度通常对抗生素的活性与毒性具有显著影响，很有可能是因为控制溶液中脂肽的整体疏水性和寡聚状态[26]。对于带有脂肪酰基侧链的环脂肽，随着脂肪酸侧链长度不断增加，其体外抗菌活性也不断增加，体内抗菌活性也遵循类似的趋势，但超过11个碳原子后毒性增加。比如对于A21978C和A54145来说，当脂肪酸侧链分别为含12、13和14的碳原子时，它们的体外抗菌活性达到最优状态。但需要注意的一点是，含碳原子数为11是一个临界值，当超过这个值后，虽然体外活性有所增加，此时体内的毒性也随之增强。对于达托霉素衍生物而言，当脂肪酸链长度增长时，其抗菌活性随之增加。当脂肪酸链含有碳原子数为6-9个时，衍生物的抗菌活性低于达托霉素，但超过10个碳原子时虽活性有所增加，却具有更高的体内毒性，此时达托霉素药效学最优。通过研究人们发现，通过对脂肽类抗生素连接的脂肪酸侧链进行结构改造或修饰，可以增强其抗菌活性，从而减少体内毒性。如Lewis[27]等人使用定点诱变，改变天蓝色链霉菌合成基因簇中β-酮酰基-ACP合酶FabF3的活性位点残基，成功产生两种新型CDA衍生物，且加载的脂肪酸链长度变短，这一研究结果为工程化具有修饰脂质基团的新脂肽开发了新视角。1.2达托霉素的结构及性质近年来，革兰氏阳性菌和阴性菌对抗菌素的耐药率急剧增加，尤其是革兰氏阳性菌，如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)[28]。因此，新型抗微生物剂的开发主要集中在由耐药的革兰氏阳性病原体引起的感染上。万古霉素曾经几乎被公认为是治疗已知或疑似MRSA感染的首选药物，是抗革兰氏阳性菌的最后一道防线。然而，国外已经发现多个该药抗性菌株。达托霉素(Daptomycin)是一种新型的环脂肽抗菌剂，对多种革兰氏阳性菌具有良好快速的杀菌活性。它是由美国礼来公司于80年代初期首次发现，2003年获得批准用来治疗由革兰氏阳性菌引起的皮肤和皮肤结构感染[29]，先后在美国、英国和德国多个国家上市（商品名为Cubicin®），为临床上提供了新型治疗方案。达托霉素，分子式为C12H101N17O26，相对分子量为1620.67[30]。达托霉素是由玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)通过非核糖体肽合成酶机制生产的环状脂肽。达托霉素分子由13个氨基酸的环状多肽核心组成，其中10个C末端残基形成一个被酯键和3个氨基酸外环侧链封闭的环，末端色氨酸连接至脂肪酰基残基（癸酸）[31]。组成达托霉素的几个氨基酸残基是非标准的，包括3个D-氨基酸(D-Asn2，D-Ala8，D-Ser11)和3个非蛋白源氨基酸：鸟氨酸(Ornithine，Orn6)，3-甲基-谷氨酸(3-methylglutamicacid，MeGlu12)和犬尿氨酸(Kynurerline，kyn13)。其中的10个氨基酸形成氨基酸环，另有3个氨基酸排列成线状，这3个氨基酸末端的L-色氨酸接着一个十碳癸酸[32]。化学结构式如图1.3（A）所示。图1.3达托霉素的结构（A）和与细胞质膜的相互作用（B）[33]Figure1.3Thestructureofdaptomycin(A)anditsinteractionwiththeplasmamembrane(B)[33]达托霉素对大多数临床相关的革兰氏阳性病原体表现出有效的体外杀菌活性，确切的作用机理仍不清楚。达托霉素不可逆地结合于革兰氏阳性菌的细胞质膜，且不进入细胞质。具体结合方式尚未确定，但很可能是通过与细菌膜脂质，磷脂酰甘油（PG）的相互作用来实现的[33]，见图1.3（B）。达托霉素以Ca2+依赖性方式插入CM

，导致膜去极化并随后丢失细胞内成分，包括K+，Mg2+和ATP[34,35]。当Ca2+浓度为1.2mM时，其抗菌效力达到最大值，该浓度与人细胞外液中游离Ca2+的浓度相同[36]。达托霉素还引起K+离子的泄漏，从而导致巨大芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌膜电位的耗散。但是，所有这些都是在达托霉素浓度比MIC高出几倍的情况下进行研究的，这在体内可能是无法达到的。在存在Ca2+的MIC浓度下，达托霉素可抑制粪肠球菌中原生质体细胞的再生[37]。达托霉素结构的特殊性决定其作用机制的特殊性，也能有效避免与其它抗生素产生交叉耐药的问题，因此在临床上具有良好的市场价值和应用前景。1.3达托霉素的生物合成1996年，McHenney[38]等进行Tn5099和Tn5096转座突变分析时得出结论：达托霉素合成基因簇位于染色体的Dral和AsnI片段上[39]。经过几年时间，达托霉素的生物合成基因簇被鉴定出来，Miao[40]等在变铅链霉菌中通过异源表达验证了玫瑰孢链霉菌DNA的一个全长128kb区域，并进行完整测序，鉴定出编码非核糖体合成酶机制必要的三个亚基的三个基因，分别为dptA、dptBC和dptD。结构与功能如图1.4所示。图1.4达托霉素合成基因簇的结构与功能[40]Figure1.4Structureandfunctionofdaptomycinsyntheticgenecluster[40]达托霉素生物合成基因簇的整个长度为128kb，含有64个ORFs，由结构基因和调节基因组成。其中dptA、dptBC、dptD三个大片段基因分别编码用于组装肽核的多模块NRPS的DptA、DptBC和DptD三个亚基。DptA含有五个模块，DptBC含有六个模块，DptD含有两个模块。DptA以缩合C结构域开始，而DptD以Te域结束。DptA（684kDa）主要负责Trp1至Gly5前5个前体氨基酸的缩合；DptBC（815kDa）主要指导Orn6至D-Ser11中间6个氨基酸合成肽链；DptD（265kDa）主要负责Kyn13和3mGlu12最后2个非蛋白氨基酸的整合以及整个肽环的闭合，其末端通常是从合成酶释放肽所需的Te结构域，即达托霉素通过Te环化从酶上释放出来，最终完成达托霉素的生物合成[42]。如图1.5所示。此外，基因簇上还包含其它不可或缺的基因，它们具有转运、修饰和调控等功能。两个重要合成基因dptE和dptF位于dptA基因上游，其中dptE编码NRPS中的酰基-辅酶A连接酶（DptE），dptF编码NRPS中的酰基载体蛋白（DptF），这两种蛋白被认为是达托霉素生物合成的起始合成模块。DptE和DptF参与达托霉素的酰化过程：正癸酸经过DptE催化，消耗ATP形成脂酰-AMP，而后被转移到经4’-磷酸泛酰巯基乙胺(PPE)修饰的DptF上，从而酰化N端的Trp1，启动达托霉素的合成第一步[43]。位于NRPS下游的附属基因dptG，它是达托霉素合成过程中的一个正调控基因，分析表明其参与调节抗生素的表达或输出，但详细的作用机理尚未见报道[44]。基因dptH在合成过程中主要起到提高整个生物合成效率的关键作用，主要通过处理合成途径中出现的错误底物[40]。基因dptI和dptJ则编码在非蛋白氨基酸前体形成中起作用的关键酶，其中dptI是谷氨酸甲基转移酶，负责促进α-酮戊二酸完成3mGlu12的生物合成，dptJ编码色氨酸-2,3-双加氧酶，主要负责催化Trp降解合成Kyn13。另外，可能还存在基因dptP与抗生素转运相关，dptR1-3参与基因表达调控等等[45]。图1.5达托霉素的生物合成途径[42]Figure1.5Thebiosyntheticpathwayofdaptomycin[42]1.4达托霉素的结构改造微生物次级代谢过程中不可避免地伴随大量非目的次级代谢产物的产生。玫瑰孢链霉菌的次级代谢产物主要是A21978C混合物，A21978C是从玫瑰孢链霉菌发酵液中分离提取出来的多组分产物，达托霉素是其中一个微量组分，所占比例十分低。达托霉素作为第一个被批准在临床上使用的环脂肽类抗生素，全新的结构类别，强大的抗菌活性和特殊的抗菌机制，促使达托霉素具有强大的临床应用潜力。一直以来人们着眼于达托霉素的分子结构，尝试利用各种手段对其进行改造和优化，最终在保证高活性和低毒性的前提下，获得更加高产的达托霉素。1.4.1传统菌种改造法最初，研究者为了获得高产菌株和高产量的达托霉素，只能够采用诱变或代谢等经典、传统的方式对野生型菌株进行改造。卢文玉等[46]将低功率氦氖激光照射应用在达托霉素上，获得了高产的玫瑰孢链霉菌阳性突变株。对野生菌株和突变菌株分别进行发酵后，发现突变株产量比野生菌株高146%。建立动力学模型进行分析，证实突变菌株在提高对癸酸耐受性的同时，产生了更多的达托霉素。胡昌华等[47]通过构建neo报告基因和获得突变株库来筛选达托霉素高产菌株，也顺利获取一株较为稳定的阳性菌株，且达托霉素产量相比于野生株提高了120。这种改造方式采用核糖体工程和代谢工程的优势，大大减轻工作量，将筛选效率从1.7提高到20。1.4.2半合成修饰法从最开始作为多组分产物A21978C家族的一个微量组分，达托霉素的分离产量十分低。A21978C分子结构中，脂肪酸侧链连接不同的酰基，这一特性使得其临床毒性较大，因此对A21978C各类化合物的酰基侧链进行结构修饰显得十分必要。Boeck[48]利用高效脱酰酶将A21978C环外脂肪酸侧链连接的酰基水解掉，在只有十肽环结构的情况下，再次对侧链修饰，进行酰基化处理，最终仍可获得结构各异的A21978C系列化合物。经研究证实，正癸酰修饰的达托霉素活性最优。此外，添加不同的脂肪酸也可生成不同的达托霉素衍生物。最开始，人们就是通过这种方法来制备达托霉素，但渐渐发现其路线复杂，操作麻烦，效率低下，最关键的是很难实现期望的达托霉素产量，无法满足人们的生产生活需求。1.4.3前体导向发酵法S.roseosporus发酵过程具有前体导向的特征，在发酵液中添加癸酸，就可以直接产生达托霉素[49]。因此，对发酵工艺进行选择性优化，可以有效提高达托霉素产量。M.J.Zmijewski等[50]人通过发酵产生A21978C，其生成的支链脂肪酸末端受发酵培养基中的配料影响。A21978C2的生成比例因为L-Val的存在而大幅增加;A21978C1和A21978C3的生成比例因为L-Ile的存在而增加;特别地是，当培养基中加入L-Leu时，两种全新的衍生物被检测出来。20世纪末，Huber等[51]首次提出在发酵的不同时间段分别投递癸酸，最终实现达托霉素的高产，此报道为达托霉素的工业化生产奠定了基础。通过S.roseosporus发酵，生成混合物A21978C，其次不断在发酵液中添加正癸酸，由生物酰化作用合成达托霉素。癸酸含有10个碳原子，属于中链脂肪酸。在溶液中它能轻易和细菌的磷脂层发生反应，导致其不可控地穿过细胞膜，溶液pH值降低，大量阴离子抱团成集且均带有一定的毒性，这时会产生有毒细胞的问题。为了有效避免发酵过程添加的癸酸抱团聚集，从而带来毒性这一问题，发酵时选取不同的时间节点，每次流加不同的癸酸体积是一个很有效的策略[52]。目前人们生产达托霉素时，首选的就是这种简单易操作的发酵方式。Bertetti等[53]按照正癸醛：油酸甲酯=1:1的比例，将两者配成混合溶液，并在发酵过程中不间断加入，当时间达到230h时，发酵产生的达托霉素产量高达1500mg/L。1.4.4组合生物合成法达托霉素的复杂性质为其他化学修饰带来了困难，尽管化学酶法产生少量含有容易获得的氨基酸的衍生物，但核心环肽中不同氨基酸的取代尚未通过药物化学方法进行探索。为了更好地应用到临床，寻找多种不同生物活性，治疗指数优于达托霉素的衍生物显得极其重要。研究者们在充分掌握达托霉素合成基因簇的前提下，采用组合生物合成的手段，如基因敲除和基因重组等等，定位于分子结构，实现其选择性修饰，从而产生与达托霉素有关的新型脂肽[54]。这项技术有两个要求，一是目标菌株基因已知，二是与目标化合物结构设计相关生物合成内容可得。大量研究表明，玫瑰孢链霉菌是稳定的遗传宿主，全基因组也完成测序工作。它可以进行分子遗传操作，如结合转移。而且，达托霉素的生物合成基因簇已完成测序、克隆和异源表达，因此完全符合要求。组合生物合成存在四个方向[55]：一是对NRPS的亚基进行改造；二是对NRPS的结构域进行互换；三是脂肪酸侧链修饰；四是氨基酸修饰。如图1.6所示。图1.6组合生物合成的4个方向[55]Figure1.6Fourdirectionsofcombinatorialbiosynthesis[55]A54145和CDA是达托霉素的结构类似物，它们拥有相似的NRPS。将达托霉素的DptD合成基因和A54145合成基因簇的LptD，CDA合成基因簇的CDAPS3进行相互替换，进行完成亚基改造。该种情况下可以生成一种达托霉素衍生物，此时第13个氨基酸为Ile或Trp而并非Kyn13。将DptD替换为lpD后，衍生物的生成量占达托霉素生成量的1/4；将DptD替换为CDAPS3后，衍生物的生成量占达托霉素生成量的1/2。产量之所以降低，很大程度上是因为dptBC与互换的基因产生冲突[55]。研究表明，对第12和第13个氨基酸进行改造，此时表面活性剂对产品的抑制程度受到了很大的影响，如某些衍生物改造后会带有Ile13或Val13，此时若有表面活性剂，Ile13和Val13的MIC都会减少为原来的八分之一；