【《强力霉素脂质体的制备及其表征实验分析》3300字】

强力霉素脂质体的制备及其表征实验分析目录TOC\o"1-3"\h\u321131.1实验材料 1212921.2实验方法 1130291.1.1强力霉素测定方法 170831.1.2强力霉素脂质体的制备方法的选择 224271.3.3粒径和电位的测定 3183881.3.4强力霉素脂质体制备工艺的考察 3135321.3.5处方验证 4305201.4结果与分析 4201581.4.1强力霉素测定方法 4316291.4.2强力霉素脂质体的制备方法的选择 5280111.4.3强力霉素脂质体制备工艺的考察 7142421.3.5处方验证 980591.4小结 101.1实验材料表2-1实验试剂Table2-1Reagentsintheexperiment试剂名称生产厂家强力霉素（USP级）索莱宝，北京大豆卵磷脂（药用>95%）阿拉丁，上海胆固醇（生化醇）阿拉丁，上海二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000AvantiPolarLipids，Alabaster1.2实验方法1.1.1强力霉素测定方法（1）强力霉素标准曲线的测定（a）检测波长称量适量的强力霉素溶于去离子水中，定容于25ml容量瓶中。将去离子水作为参比溶液和强力霉素溶液一起，在在200~600nm波长区间测定吸光度，光谱扫描结果显示强力霉素在350nm处出现最大吸收值，且在其他波长处无明显吸收，将强力霉素检测波长确定为350nm。（b）线性关系考察精确称取适量强力霉素加去离子水溶解，配置成2mg/ml的标准溶液备用。分别取0、30、60、90、120微升强力霉素标准溶液于离心管中，加去离子水至4ml，在350nm处测定吸光度，选择强力霉素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归分析，绘制标准曲线。（c）精密度考察精密移取备用溶液配置成低(15μg/mL)、中(30μg/mL)、高(45μg/mL)三个浓度的强力霉素标准品溶液，在一天之内测5次标准溶液的吸光度且连续测三天，以用来考察方法的精密度。（2）强力霉素脂质体包封率的测定将制得的强力霉素脂质体放于超滤离心管（10KDa）,在高速冷冻离心机中，12000rpm10℃下离心，直至将游离药物和脂质体分离，保留滤液，继续加入去离子水，并重复离心，收集滤液，一共补加3次去离子水，将所有滤液收集测定其吸光度，通过标准曲线计算游离强力霉素含量。已知强力霉素投入总量为A1，测出游离强力霉素含量为A2。得到包封率，计算公式为：包封率（%）=[（A1－A2）/A1]×100%1.1.2强力霉素脂质体的制备方法的选择（1）薄膜分散法制备强力霉素脂质体将适量的大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000溶于少量乙醇，超声20min。用旋转蒸发仪（45℃恒温水浴）减压旋蒸至无酒精，脂质体贴于圆底烧瓶底部，取8ml去离子水加入圆底烧瓶。50℃下超声10min至脂质体脱落。形成空白脂质体。加入强力霉素溶液，使脂质体充分溶胀后涡旋1min，超声10min至脂质体脱落。制得半透明的脂质体溶液。（2）乙醇注入法制备强力霉素脂质体将适量的大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000溶于少量乙醇中，取去离子水至于50℃水浴锅中加热，在磁力搅拌下，将将溶有脂质的少量乙醇溶液匀速滴加至去离子水中。在滴加结束后，继续搅拌15min，倒入瓶中水浴中抽真空除去乙醇。制得强力霉素脂质体。（3）逆向蒸发法制备强力霉素脂质体将适量的大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000溶于少量乙醇中，取强力霉素溶于磷酸盐缓冲液中，将乙醇溶液和磷酸盐缓冲液混合，超声处理，形成稳定的W/O乳剂，减压蒸发除去乙醇，加入磷酸盐缓冲液，旋转使壁上的凝胶脱落，继续减压蒸发完全除去乙醇，形成强力霉素脂质体。1.3.3粒径和电位的测定利用动态光散射仪（Malverninstrumentslimitedzen3600）检测三种方法分别制备脂质体的粒径和表面Zeta电位，分别取三组脂质体用去离子水将脂质体稀释至浓度为1mg/ml,在室温下测定粒径和表面zeta电位，每组实验重复三次。1.3.4强力霉素脂质体制备工艺的考察（1）强力霉素加入量胆固醇加入量固定为4mg，大豆卵磷脂加入量为20mg，DSPE-PEG20002mg，水浴温度为50℃，改变强力霉素的加入量，考察强力霉素加入量对脂质体包封率的影响。强力霉素加入量分别为2mg、4mg、8mg、20mg、12mg。按照薄膜分散法制备强力霉素脂质体。（2）胆固醇加入量控制强力霉素加入量为8mg，大豆暖磷脂加入量为20mg，DSPE-PEG20002mg，水浴温度为50℃，改变胆固醇的加入量，考察胆固醇加入量对包封率的影响。胆固醇加入量分别为0mg、12mg、4mg、6mg、8mg。按照薄膜分散法制备强力霉素脂质体。（3）大豆卵磷脂加入量胆固醇加入量固定为4mg，强力霉素加入量为2mg，DSPE-PEG20002mg，水浴温度为50℃，改变大豆卵磷脂的加入量，考察大豆卵磷脂加入量对包封率的影响。大豆卵磷脂加入量分别为12mg、16mg、20mg、24mg、18mg。按照薄膜分散法制备强力霉素脂质体。（4）制备温度控制大豆暖磷脂加入量为20mg，胆固醇加入量固定为4mg，强力霉素加入量为2mg，DSPE-PEG20002mg，改变水浴温度，考察温度对包封率的影响。水浴温度分别为40、45、50、55、60℃。按照薄膜分散法制备强力霉素脂质体。1.3.5处方验证(1)包封率的测定按上述最佳处方构建强力霉素脂质体，重复三次实验，测出脂质体的包封率。(2)电位及粒径的测定利用动态光散射仪检测三批构建的强力霉素脂质体，用去离子水将脂质体稀释至浓度为1mg/ml,在室温下测定粒径和表面zeta电位，每组实验重复三次。1.4结果与分析1.4.1强力霉素测定方法1.4.1.1标准曲线图2-1强力霉素标准曲线Fig.2-1StandardcurveofDoxycycline紫外-可见分光光度法检测强力霉素含量，标准曲线如图2-1所示，即吸光度（Y）与强力霉素浓度（x）之间标准曲线为y=0.0242x+0.0142，线性相关系数（r）为0.999，符合检测标准要求。1.4.1.2精密度表2-1强力霉素日内和日间精密度（n=3）Table2-1PrecisionofdeterminationofDoxycycline（n=3）浓度（µg/mL）日内平均值RSD%日间平均值RSD%150.380.620.391.64300.740.660.761.35451.141.671.171.59强力霉素溶液的日内精密度为0.62~1.67，日间精密度为1.35~1.64，RSD值均小于2%，符合方法学要求。1.4.2强力霉素脂质体的制备方法的选择表2-2强力霉素脂质体的制备方法考察Table2-2InvestigationonthepreparationmethodofDoxycyclineliposomes方法包封率/%点位/mv粒径/nm薄膜分散法（TFV）50.57-49.51100.01逆向蒸发法（REV）45.63-13.86151.72乙醇注入法（EI）44.82-8.49191.40图2-2强力霉素脂质体电位Fig.2-2ZetapotentialofDoxycyclineliposomes图2-3强力霉素脂质体粒径Fig.2-3ParticlesizeofDoxycyclineliposomes分别用薄膜分散法（TFV）、逆向蒸发法（REV）和乙醇注入法（EI）制备强力霉素脂质体，药物包封率如表2-2所示，薄膜分散法包封率最高，表面电位如图2-2所示，薄膜分散法可制备出-49.51mv的强力霉素脂质体，强力霉素脂质体粒径如图2-3所示，依然是薄膜分散法制备出的强力霉素脂质体粒径最小为100.01nm。因此选择薄膜分散法制备强力霉素脂质体。1.4.3强力霉素脂质体制备工艺的考察（1）强力霉素加入量表2-3强力霉素加入量对包封率的影响（n=3）Table2-3EffectofdosageofDoxycyclineonentrapmentefficiency(n=3)强力霉素加入量/mg包封率/%246.70448.02854.511047.481243.67数据如表2-3可知，随着强力霉素加入量的增加，包封率先增大后降低，在8mg时有最大值，包封率约为54.51%，说明脂质体对强力霉素的包埋有饱和性。强力霉素加入量为8mg时包封率最大，则选择强力霉素用量8mg。（2）胆固醇加入量表2-4胆固醇加入量对包封率的影响（n=3）Table2-4Effectofdosageofcholesterolonentrapmentefficiency(n=3)胆固醇加入量/mg包封率/%045.82251.44454.29648.47845.31数据如表2-4所示，随着强力霉素的加入，脂质体包封率增加，当加入量为4mg时，包封率最大约为55.55%，再增胆固醇的量，脂质体包封率逐渐趋于平行，这表明胆固醇的加入可以提高双分子层的刚性，加入的过多反而会降低双分子膜流动性，因此选择胆固醇加入量为4mg。（3）大豆卵磷脂加入量表2-5大豆卵磷脂加入量对包封率的影响（n=3）Table2-5EffectofdosageofSoyLecithinonentrapmentefficiency(n=3)卵磷脂加入量/mg包封率/%1643.361847.572055.552248.682444.60如表2-5所示，随着大豆卵磷脂的加入，包封率先增大后减小，在20mg时有最大包封率，约为55.55%，因此选择大豆卵磷脂的加入量为20mg。（4）制备温度表2-5制备温度对包封率的影响（n=3）Table2-5EffectofPreparationtemperatureonentrapmentefficiency(n=3)温度/℃包封率/%4545.225054.395550.206047.934849.20如表2-5所示，随着水浴温度的上升，包封率呈现先升高后降低的趋势，在50℃时，包封率最高约54.39%，所以选取50℃为制备温度。1.3.5处方验证(1)包封率的测定按照强力霉素加入量为8mg，大豆卵磷脂的加入量为20mg，胆固醇加入量为4mg，制备温度为50℃构建强力霉素脂质体，命名为LD，包封率分别为56.43%、54.82%、56.06%，平均为55.77%，三次验证测定结果基本一致，所以上述考察的处方工艺可行，重复性良好。(2)电位及粒径的测定图2-4强力霉素脂质体电位Fig.2-4ZetapotentialofDoxycyclineliposomes图2-5强力霉素脂质体粒径Fig.2-5ParticlesizeofDoxycyclineliposomes如图2-4、2-5，这三批脂质体平均粒径为101.9(n=3)，分布良好。电位平均值为-47.3mV(n=3)。三次验证测定结果基本一致，所以上述考察的处方工艺可行，重复性