CN119487044A 一种新型硫醇还原剂及其制备方法和用途 （苏州佰睿壹生物技术有限公司）

2022.08.222022.09.202022.09.202022.11.112023.01.192024.12.05PCT/CN2023/114320202WO2024/041545EN2024.02.29本公开涉及一种具有式(I)的新型硫醇还原2R1为23R41_C5烷基2为H。)2。R6为05羟烷基15烷氧基3R6为2)232CH3)n14_CH2CONHOH或5R1为23R41_C5烷基620.如权利要求113中任一项所述的还原剂或权利要求1416中任一项所述的组合物23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述抗7(A3)在缓冲体系中孵育第二还原剂，以选择性地还原步骤(A2)中产生的链间二硫键，(B3)引入第二有效载荷毒素单元，以与步骤(B2)中产生的还原的硫醇基团进行反应，8步骤(A3)和(B2)中的所述孵育时间各自独立地为0.5小时至24小时、0.5小时至12小2+45.如权利要求24所述的方法，其特征在于，在步骤(A2)中℃,和/或所述氧化时间为1小时至48小时；视情况，所述氧化温度为0℃至30℃,和/或所述9在所述缓冲体系中孵育所述金属螯合剂和所述第一连接子58.通过权利要求22一54中任一项所述的方法制备的具有位点特异性修饰的抗体或权59.一种在有需要的受试者中预防或治疗疾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗[0005]抗体药物偶联物(ADC)是一种创新型生物制药产品，通过合适的连接子将单克隆个暴露的巯基。Cys偶联方法和Lys偶联方法两者都会产生异质混合物。(“AdvancesandLimitationsofAntibodyDrugConjugatesforCancer”(用于癌症的抗体药物偶联物[0007]药物抗体比(DAR)或与单个抗体偶联的药物分子的数目对于决定ADC的药效非常就是基于通过抗体工程提高ADC的均一性而开发的，通过在抗体的一级序列中引入半胱氨酸，实现位点特异性偶联来提高产品的均一性(“Cysteine_Based[0009]US20210040145公开了一种由14个氨基酸组成的短肽Tub_tag，可应用于任何POINH23R4，NH23R4[0048]在一些实施例中，抗体的Fab区中的两个链间二硫键和抗体的铰链区中的一个链[0050](A2)引入氧化剂，以选择性地对步骤(A1)中产生的被还原的硫醇基团进行再氧[0052](A3)在缓冲体系中孵育第二还原剂，以选择性地还原步骤([0064]图1显示了示例32制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色谱[0065]图2显示了示例33制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色谱[0066]图3A_H显示了示例34至41制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_[0067]图4A_H显示了示例42至49制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_[0068]图5A_H示出了实例50_57制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_[0069]图6示出了比较示例5制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC[0070]图7A_B示出了实例58_59制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_[0071]图8显示了示例60制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色谱[0072]图9显示了示例61制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色谱[0073]图10显示了示例62制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0074]图11显示了示例63制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0075]图12显示了示例64制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0076]图13显示了示例65制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0077]图14显示了示例66制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0078]图15显示了示例67制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0079]图16显示了示例68制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0080]图17显示了示例69制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0081]图18A_C示出了实例70_72制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_[0082]图19A_F示出了实例73_78制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_[0083]图20示出了比较示例1制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC[0084]图21A_C示出了比较示例2_4制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的[0085]图22显示了示例79制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0086]图23显示了示例80制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0087]图24显示了示例81制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0088]图25显示了示例82制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0089]图26显示了示例83制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0090]图27显示了示例84制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0091]图28显示了示例85制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0092]图29A_E示出了实例86_90制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_[0093]图30显示了示例91制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0094]图31显示了示例92制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0095]图32显示了示例93制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0096]图33显示了示例94制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0097]图34显示了示例95制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色[0098]图35A_G示出了实例96_102制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_[0099]图36A_E示出了实例103_107制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的[0100]图37A_C示出了实例108_110制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的[0101]图38A_F示出了实例111_116制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的[0102]图39A_C示出了实例117_119制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的[0103]图40示出了实例120的曲妥珠单抗_[双马来酰亚胺_DBCO]3偶联物的HIC_HPLC色[0104]图41A示出了实例121的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的HIC_HPLC色谱图；图41B示出了实例121的曲妥珠单抗_[0105]图42A示出了实例122的曲妥珠单抗_[MC_GGFG_DXd]6偶联物的HIC_HPLC色谱图；图42B示出了实例122的曲妥珠单抗_[MC_GGFG_DXd]6[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]1偶[0106]图43A显示了示例123的曲妥珠单抗_[马来酰亚胺]6偶联物的HIC_HPLC；图42B显[0107]图44显示了示例124的曲妥珠单抗_[马来酰亚胺]6[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_[0108]图45示出了实例125制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC色[0109]图46示出了实例126制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC色[0110]图47示出了实例127制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC色[0111]图48示出了实例128制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC色[0112]图49示出了实例129制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC色[0113]图50示出了实例130制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC色[0114]图51示出了实例131制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC色[0115]图52示出了实例132制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC色[0116]图53示出了实例133制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC色[0117]图54A_H示出了实例134_141制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的[0118]图55A_F示出了实例142_147制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的[0119]图56A_C示出了实例148_150制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的[0120]图57A_H示出了实例151_158制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的[0121]图58A_H示出了实例159_166制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的[0122]图59示出了比较示例6制备的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC[0123]图60显示了示例167中曲妥珠单抗_[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]1偶联物的[0124]图61示出了实例168的曲妥珠单抗_[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]1[MC_VC_[0125]图62示出了实例169的曲妥珠单抗_[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]1[MC_VC_[0126]图63A显示了示例170的曲妥珠单抗_[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]1偶联物的VC_PAB_MMAE]4偶联物的HIC示出了实例172的曲妥珠单抗_[MC_GGFG_DXd]2[MC_VC_PAB_MMAE]4偶联物的HIC_HPLC色谱[0128]图65A示出了实例173的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物的HIC_HPLC色谱图；B_C示出了实例173_174的曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2[MC_GGFG_DXd]4偶联物的NH23R4，2)322)422)522)6COOH或_CH(CH3)COOH。22)5_。)22CH2CH3。)2。C2C32羟烷基3羟烷基4羟烷基5羟烷基1烷氧基烷基磺酰基、C2烷基磺酰基、C3烷基磺酰基、C5烷基磺酰基、C5烷基磺酰基、或_(CH2)n1CH22)232CH32CH22)3、_(CH2)4_OCH32CH36H5)3。8)CO(R7)，[0200]R5和R6独立地为C1_C5烷基、C0_C5羟烷基、任选取代的杂芳烷基或_(CH2)n14羟烷基5羟烷基2)n1(OCH2CH2O)[0210]在一些实施例中，Y为Z为在一[0215]在一些实施例中，过渡金属离子与上述第一还原剂的摩尔比为0.05:1至40:1、NH23R4，唑1基)N,N,N',N'四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)。[0242]在一些实施例中，具有式(I)的还原剂可以选择性地还原抗体的链间二硫键之中[0244]在一些实施例中，本文提供了具有上述式(I)的还原剂和上述组合物在还原抗体[0245]在一些实施例中，具有式(I)的还原剂在制备具有位点特异性修饰的抗体方面的[0246]将通过常规偶联过程或本发明的生物偶联过程，生成抗体药物偶联物的混合物。效载荷毒素的第一硫代桥接基团中的一个对一个单一抗体分子的两个硫醇基团进行了再效载荷毒素的第一硫代桥接基团中的三个对一个单一抗体分子的六个硫醇基团进行了再载荷毒素的第二硫代桥接基团中的一个对一个单一抗体分子的八个硫醇基团进行了再桥第二硫代桥接基团中的一个对一个单一抗体分子的二个硫醇基团进行了第一连接子有效载荷毒素和第二连接子有效载荷毒素可以相同或不同。一连接子有效载荷毒素和第二连接子有效载荷毒素可以相同或一连接子有效载荷毒素和第二连接子有效载荷毒素可以相同或[0283]本公开还提供了一种使用具有式(I)的还原剂及其修饰抗体来制备具有位点特异[0286]在一些实施例中，抗体的Fab区中的两个链间二硫键和抗体的铰链区中的一个链[0289]在一些实施例中，步骤(A2)中的氧化剂对抗体Fab区中的还原的硫醇基团进行再的链间二硫键，视情况可还原一个或两个链间二硫键。在一些实施例中，采用步骤(A1)、[0312]在一些实施例中，步骤(A1)中过渡金属离子与第一还原剂的摩尔比为0.05:1至[0314]在一些实施例中，步骤(A1)中过渡金属离子与第一还原剂的摩尔比为0.08:1、[0327]在一些实施例中，在步骤(A[0365]在一些实施例中，步骤(B3)中金属螯合剂与抗体的摩尔比为1:1至100:1、1:1至[0368]在一些实施例中，步骤(B2)中的第二还原剂与抗体的摩尔比独立地为0.05:1至(A2)、步骤(B1)和步骤(B2)，在步骤(B2)中，第二还原剂与过渡金属离子的摩尔比为1:0.05至1:40，和/或第二还原剂与抗体的摩尔比为3:1至15:1，且孵育时间为1小时至12小还原剂与过渡金属离子的摩尔比为1:0.05至1:40，和/或第二还原剂与抗体的摩尔比为[0407]方法中的步骤(A1)、(A3)和(B2)中的缓冲体系的浓度独立地处在10mM至100mM以使用疏水相互作用色谱法(HIC)施加进子选自符合以下要求的任何连接子：其一个末端可以连接到抗体的还原的硫醇基团或硫酸缬氨酸瓜氨酸(GVC)、甘氨酸甘氨酸甘氨酸(GGG)、苯丙氨酸苯丙氨酸赖氨酸与硫代桥接试剂中的反应性基团发生反应时，第一连接子有效载荷毒素和/或第二连接来新(adezelesin)、蒽环类(anthracyclin)、卡泽来新、比泽来新、多拉司他汀[0442]在一些实施例中，带有反应性基团的第一硫代_桥接试剂可能与带有反应性基团[0443]在一些实施例中，带有反应性基团的第一硫代_桥接试剂和带有反应性基团的第二硫代_桥接试剂为具有下式的二溴马来酰亚胺_二连接子有效载荷毒素的第二硫代桥接试剂在连接子有效载荷毒素的第一硫代桥接试剂的连接子和带有第二连接子有效载荷毒素的的第一硫代桥接试剂的硫代桥接试剂和带有第二连接子有效载荷毒素的第二硫代桥一硫代桥接试剂的硫代桥接试剂和带有第二连接子有效载荷毒素的第二硫代桥接试FcyR、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在其他实例[0485]在一些实施例中，对人IgG恒定区进行修饰，以改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC) 特异性抗体。在本发明的一些实施例中，该双特异性抗体可以通过杵臼结构(Knobs_in_antibodyCH3domainsforheavychainheterodimerization(重链异源二聚化抗体CH3 11).、格式链交换(FORCE)技术、通用轻链格式技术(DeNardisC、HendriksLJA、PoirierE等人。AnewapproachforgeneratingbispecificantibodiesbasedonacommonlightchainformatandthestablearchitectureofhumanimmunoglobulinG1(一种基于通用轻链格式和人免疫球蛋白G1稳定结构生成双特异性抗体的新方法)[J].Fab臂交换技术(YanakievaDe、PekarL、EversA等人。Beyondbispecificity:ControlledFabarmexchangeforthegenerationofantibodieswithmultiple specificities(超越双特异性：受控Fab臂交换生成具有多特异性的抗体)[J].《抗体》 useofCrossMAbtechnologyforthegenerationofbi_andmultispecific重链的CH2结构域和具有臼突变的另一条重链的CH2结构域、和/或具有杵突变的一条重链基被携带较小侧链的另一个氨基酸残基取代，从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔[0492]在一些实施例中，该抗体具有靶向特异性，其靶向于HER2(人表皮生长因子受体PAB_MMAE]6、玛贝兰妥单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6、曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6[MC_[马来酰亚胺]6[MC_VC_PAB_MMAE]2、曲妥珠单抗_[马来酰亚胺]6[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]1、曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2、曲妥珠单抗_[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]1[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]1[MC_VC_PAB_MMAE]2、曲妥珠单抗_[马来酰亚胺_PEG4_[0498]本公开还提供了具有位点特异性修饰的抗体，其中抗体的Fab区中的两个链间二第一连接子有效载荷毒素反应的)带有反应性基团的第一硫代桥接试剂，并且第二有效第一连接子有效载荷毒素反应的)带有反应性基团的第一硫代桥接试剂，并且第二有效[0516]本公开还提供了具有位点特异性修饰的抗体，其中抗体的Fab区中的两个链间二具有位点特异性修饰的抗体(具有D6+D2的ADC)，其中第一有效载荷毒素单元为第一连接具有位点特异性修饰的抗体(具有D6+D1的ADC)，其中第一有效载荷毒素单元为第一连接具有位点特异性修饰的抗体(具有D6+D1的ADC)，其中第一有效载荷毒素单元为第一连接接子有效载荷毒素的第一硫代桥接试剂，并且第二有效载荷毒素单元为第二连接子有接子有效载荷毒素反应的)带有反应性基团的第一硫代桥接试剂，并且第二有效载荷毒接子有效载荷毒素的第一硫代桥接试剂，并且第二有效载荷毒素单元为带有第二连接子有效载荷毒素的第二硫代桥接试剂。接子有效载荷毒素反应的)带有反应性基团的第一硫代桥接试剂，并且第二有效载荷毒第一连接子有效载荷毒素反应的)带有反应性基团的第一硫代桥接试剂，并且第二有效连接子有效载荷毒素的第二硫代桥接试剂。第一连接子有效载荷毒素反应的)带有反应性基团的第一硫代桥接试剂，并且第二有效硫代桥接试剂，并且第二有效载荷毒素单元为带有第二连接子有效载荷毒素的第二硫制备的具有位点特异性修饰的抗体(具有D0+D3的ADC)，其中第一有效载荷毒素单元为硫剂可以包括可供注射的无菌和/或非致热溶液、可供使用前与溶剂混合的无菌可溶性干品人需求以及以及施用或监管组合物施用的人员的专业判断，随时间调整具体的给药方案。或药效动力学参数可以包括诸如毒性作用之类的临床效应[0566]脱盐柱(类型：40K，0.5mL，参考号：87766，批号：SJ251704)可从Thermo28.6mM的K2HPO40.00100.00.02.00100.00.00.0100.00.0100.0100.00.020.00100.00.0为TCEP_NO_Trtyl或TCEP_19_int1)，MS[M_H]_＝506.2，C28H30NO6P的精确质量计算值为δ2.93_2.85(m,4H),2.73_2.56(m,8H3当量)中。将反应物在室温下搅拌60min。之后，在真空中去除DMF，并且将残渣加入到[0596]TCEP_1在合成程序B_1中合成，其中TCEP_1_int3为胺试剂，得到白色固体状的固体状的TCEP_3(65.0mg，33％)。MS[M_H]_＝396.24，C18H24NO7P的精确质量计算值为[0606]向乙醇胺(610mg，10mmol，1.0当量，Adamas)的DMC(20mL)溶液中加入咪唑[0608]TCEP_4在合成程序B_1中合成，其中TCEP_4_int1为胺试剂，得到白色固体状的(13.0mg，9.3％)。MS[M+H]+＝280.22，C10H18NO6P的精确质量计算值为279.0HC15H20NO7P的精确质量计算值C16H20NO8P的精确质量计限公司)为胺试剂，得到棕色固体状的TCEP_11(10.5mg，4.9％)。MS[M+H]+＝432.24，液体形式的产物TCEP_18_int1C12H15O4P的精确质量计算值为254.07。1HNMR(400MHz,DMSO_d6)：δ7.74(dd,J＝10.9,溶液中加入DIPEA(3.5mL，20mmol，4当量)，然后加C15H21N2O6P的精确质量计算值为356.31。C17H20NO9P的精确质量计算体状的TCEP_25(51.3mg，17.2％)。MS[M+H]+＝399.25，C17H23N2O7P的精确质量计算值为TCEP_26(31.5mg,收率21.3％)。MS[M+H]+＝396.17，C13H22N3O9P的精确质量计算值为[0679]向邻三苯甲基羟胺(1.4g，5.0mmol，1.0当量)的DMF(15mL)溶液中加入DIPEA水(30mL)洗涤，用Na2SO4干燥并过滤。滤液通过闪蒸塔进行浓缩和纯化，得白色固体状的该混合物在室温下搅拌2h。反应混合物通过闪蒸塔进行浓缩和纯化，得无色油状的TCEP_C18H24NO8P的精确质量计算值为C18H23NO7P的精确质C19H23N2O7P的精确质量计算C16H22NO6P的精确质量计算值并且在室温下搅拌5h。LCMS显示反应已完成。浓缩反应混合物，并且将残渣倒入冰水中偶联物(具有D6的ADC)的制备实例33的方实例32_57中使用本申请中的还原剂制[0724]实例58_78的制备方式类似于实例33中具有D6的ADC的制备，但它在步骤(a)中调[0730]实例58_78的结果如表2所示。如表2所示的结果，连接子_有效载荷毒素(MC_VC_[0734]曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的制备类似于实例32中ADC的制备，但还[0744]曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的制备类似于实例82中的ADC的制备，025800490048035700770.963.894.0584.656.4671.452.0904.8386.557.404.675.5483.5403.703.9088.114.288.8320.3666.552.8507.5952.1022.89[0753]曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的制备类似于实例82中ADC的制备，但调06.218.0580.675.0705.3477.023.7502.7379.283.3825.4158.490024.2860.53[0761]曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的制备类似于实例82中ADC的制备，但调05.836.3284.063.795.143.7285.503.9507.106.9583.642.31[0767]实例111_119：曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]6偶联物的制备(步骤(1)中的还原[0768]实例111_119的方法与实例32基本相同，不同之处在于步骤(1)中的还原时间和/10:1，并且步骤(1)中的还原剂时间为4小时至22小时时，D6的含量高达75甚至高达[0777](1)将ZnCl2(0.024mM)和还原剂TCEPA(0.048mM)加入到单克隆抗体曲妥珠单抗[0782]中间体2：向1(6.5g，50.0mmol，1.0当量)的DMF(100mL)的混合物中加入DBU耗。将混合物倒入冰水(300mL)中，用EtOAc(100mL*3)萃取。合并有机层，用盐水洗涤0.16mmol，1.0当量)的DCM(2mL)混合物中加入TFA(100uL)。混合物在室温下搅拌1小时。该混合物在室温下搅拌1h。LCMS显示中间体6被完全消耗。浓缩混合物，通过制备型HPLC(水/MeCN＝10～50％)纯化残渣，并且冻干洗脱液，得到白色固体状的产物7(28.8mg，82.93[0789]如表所示，结果证实，曲妥珠单抗_[双马来酰亚胺_DBCO]3的含量通常高达82备[0791](1)将ZnCl2(0.024mM)和还原剂TCEPA(0.048mM)加入到单克隆抗体曲妥珠单抗[0793](3)将步骤(2)的所得产物和第二还原剂TCEP(04.484.9786.494.063.673.8884.817.654干燥[0805](1)将ZnCl2(0.024mM)和还原剂TCEPA(0.048mM)加入到单克隆抗体曲妥珠单抗[0807](3)将步骤(2)的所得产物和第二还原剂TCEP([0809]其中平均约有6个药物分子MC_GGFG_DXd与曲妥珠单抗偶联，并且平均约有1个药物分子马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3与4.58692.253.50[0814](1)将ZnCl2(0.024mM)和还原剂TCEPA(0.048mM)加入到单克隆抗体曲妥珠单抗[0815](2)引入EDTA(0.6mM)和(2_氨基乙基)马来酰亚胺(0.1mM)以与步骤(1)中产生的[0816](3)将曲妥珠单抗_[马来酰亚胺]6和第二还原剂TCEP(0.02mM)在37℃下孵育18小////24.305.1870.53[0822](1)将ZnCl2(0.024mM)和还原剂TCEPA(0.048mM)加入到单克隆抗体曲妥珠单抗[0824](3)将曲妥珠单抗_[马来酰亚胺]6和第二还原剂TCEP(0.02mM)在37℃下孵育18小并且反应时间为8h，然后使用脱盐柱回收曲妥珠单抗_[马来酰亚胺]6[马来酰亚胺_PEG4_79.403.60[0830](1)将ZnCl2(0.012mM)和制备的还原剂TCEPA(0.048mM)加入到单克隆抗体曲妥珠[0831](2)将DHAA(0.072mM)加入到步骤([0835]示例126至147：曲妥珠单抗_[MC_VC_PAB_MMAE]2偶联物(具有D2的ADC)的制备实43007000800000000050006530600075007.2481.270022.4371.725.850026.9300085.322.260032.5567.4500033.5766.430002.3460.6433.303.7204.5087.687.82006.1992.05008.4991.510002.2326.06004.4891.943.58007.3692.640008.0691.94000[0845]当在氧化后进行纯化时，D6的比例高达95这表明纯化操作可以显著提高具有[0847]如实例125_147中所示，当DHAA与抗体的摩尔比为4:1至22:1时，D2的含量高达含量高达80％、甚至高达95并且步骤(2)中的氧化时间为1小时至48小时示例151至166Bis_Tris,pH6.787.966.5300PIPES,pH6.74.4600PB,pH6.738.3461.67000HEPES,pH7.06.0691.512.4300MOPS,pH7.06.3687.386.2600DIPSO,pH7.47.1992.81000MOBS,pH7.46.1893.83000MOPSO,pH7.45.7092.182.1200TES,pH7.45.6691.752.5900ACES,pH7.492.29000TAPSO,pH7.44.7792.262.9800MESpH5.83.4860.4832.663.390MESpH6.14.1222.3700BES,pH6.43.5776.4500BES,pH6.782.250BES,pH7.43.0594.482.4800ADA,pH6.786.47000[0859](1)将TCEPA(0.048mM)和ZnCl2(0.012mM)加入到曲妥珠单抗(0.012mM)的BES缓冲[0862](4)在BES缓冲液(20mM，pH7.0)中孵育曲妥珠单抗_[马来酰亚胺_PEG4_N3]183.813.13[0868](1)引入实例167中制备的曲妥珠单抗_[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]17.7988.024.20[0874](1)在BES缓冲液(pH7.0，20mM)中孵育ZnCl2(0.8mM)、第二还原剂TCEP_6(0.0144mM)和实例167中制备的曲妥珠单抗_[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]13.727.9273.804.06[0880]示例170至171：曲妥珠单抗_[马来酰亚胺_PEG4_N3_DBCO_Cy3]1[MC_VC_PAB_[0881]