CN119487208A 用于处理聚合物分析物的方法和系统 （格里菲克生物技术公司）

2024.12.06PCT/US2023/0179542023.04.07WO2023/196642EN2023.10.12物聚合物)的新颖方法。用于处理聚合物分析物的方法可以包括将聚合物分析物的单体偶联至24.如权利要求2或3所述的方法，其中在(iv)期间，所述8.如权利要求6所述的方法，其中所述第一可聚合分子和所述激活可聚合分子是核酸促进所述第一可聚合分子与所述第二可聚合分分子被配置为偶联至邻近所述第二可聚合分子的附321.如权利要求2所述的方法，其中所述结合剂包述激活核酸序列。22.如权利要求21所述的方法，其进一步包括经由杂23.如权利要求22所述的方法，其中所述生成包括(A且进一步包括使用所述瓣状序列以将所述第一可聚合分子偶联至所述第二可28.如权利要求27所述的方法，其中在(e)期且进一步包括将所述第一可聚合分子偶联至所述激活可至少一部分互补的序列。并且进一步包括经由杂交链式反应(HCR)生成所述第33.如权利要求32所述的方法，其中所述生成包括(4且进一步包括使用所述瓣状序列以将所述第一可聚合分子偶联至所述第二可35.如权利要求33所述的方法，其进一步包括将附加第一发夹分子偶联至所述第一可36.如权利要求35所述的方法，其进一步包括将所述附加第一可聚合分子偶联至附加所述附加发夹分子的至少一个子集包含与所述第一发夹分子或所述第二发夹分子不同的序列。39.如权利要求38所述的方法，其中所述附加发夹分子的所述子集包含被配置为偶联分子被配置为偶联至邻近所述第二可聚合分子的附45.如权利要求43所述的方法，其中所述酶是辣根过氧化物酶552.如权利要求47_51中任一项所述的方法，其中所述第一可聚合分子包括核酸分子，并且进一步包括经由杂交链式反应(HCR)生成所述第53.如权利要求52所述的方法，其中所述生成包括(且进一步包括使用所述瓣状序列以将所述第一可聚合分子偶联至所述第二可55.如权利要求47_54中任一项所述的方法，其所述锚定核酸分子被配置为偶联至邻近所述第二可聚合分子的附加第二可聚59.如权利要求58所述的方法，其中所述酶是辣至少一部分互补的序列。64.如权利要求61_63中任一项所述的方法，其中所述第一可聚合分子包括核酸分子，并且进一步包括经由杂交链式反应(HCR)生成所述第65.如权利要求64所述的方法，其中所述生成包括(A)6且进一步包括使用所述瓣状序列以将所述第一可聚合分子偶联至所述第二可67.如权利要求61_66中任一项所述的方法，其中所述所述锚定核酸分子被配置为偶联至邻近所述第二可聚合分子的附加第二可聚68.如权利要求61_67中任一项所述的方法，其中所述70.如权利要求68所述的方法，其中所述酶是辣78.如权利要求77所述的方法，其中所述接头包含能够偶联至所述单体的第一反应性(b)使用所述接头以将所述多个氨基酸中的所述氨基酸或另外的氨基酸偶联至所述底783.如权利要求81所述的方法，其中所述捕获部分包含第一点击化学部分并且其中所述接头包含第二点击化学部分，并且其中(c)中的所述偶联包括使所述第一点击化学部分84.如权利要求80_83中任一项所述的方法，其中所述进一步包括将所述核酸条形码分子偶联至所述激活可聚分互补的序列。86.如权利要求80_85中任一项所述的方法，其进一步包括经由杂交链式反应(HCR)生87.如权利要求86所述的方法，其中所述生成包括(A)89.如权利要求87或88所述的方法，其中在(C)之后90.如权利要求87所述的方法，其中所述核酸条形码分子包含所述第一发夹分子或所91.如权利要求80_90中任一项所述的方法，其中所述所述锚定核酸分子被配置为偶联至邻近所述核酸分子的附加核93.如权利要求80_92中任一项所述的95.如权利要求93所述的方法，其中所述酶是辣根过氧97.如权利要求80_96中任一项所述的方法，其中所8分析物的第一结合剂以及能够偶联至所述第一分析物和所述第二分析物两者的第二结合(e)使用在(d)中经鉴定的所述第一结合剂和所述第二结合剂以鉴定所述第一分析物9[0002]本申请要求于2022年11月8日提交的美国临时专利申请号63/423,602和于2022年[0004]本发明是在由美国国立卫生研究院授予的批准号HG012563下在美国政府支持下[0007]本文认识到对于用于以准确且高通量的方式表征和分析聚合物分析物如蛋白质经切割单体的结合剂或其部分接触。本文公开的方法还可以采用可聚合分子的局部拴系。[0008]在一方面，本文提供了一种用于以单分子灵敏度对包括瓣状序列(flapsequence)，并且进一步包括使用瓣状序列以将第一可聚合分子偶联分子，从而从捕获部分释放氨基酸。在一些实施方案中，核酸酶是限制酶、Cas蛋白或用氧化剂或还原剂。施方案中，(e)中的偶联包括第一核酸分子的至少一部分与第二核酸分子的至少一部分的可聚合分子包括第一核酸分子并且第二可聚合分子包括第二核酸分子。在一些实施方案括使用激酶以使第二可聚合分子磷酸化，从而允许第一可聚合分子偶联至第二可聚合分且进一步包括在第一可聚合分子与第二可聚合分子偶联之前用限制酶切割第二可聚合分生成第一可聚合分子。在一些实施方案中，生成包括(A)提供第一发夹分子和第二发夹分括具有假互补碱基的DNA分子、桥连核酸(BNA)、异种核酸(XNA)、锁核酸(LNA)、肽核酸酯(PITC)部分，并且其中(b)中的偶联包括将PITC部分偶联至氨基酸以生成氨基酸的苯基(BF3实施方案中，刺激包括使用路易斯酸。在一些实施方案中，路易斯酸包括三氟甲磺酸硼(BF3点击化学部分并且其中接头包含第二点击化学部分，并且其中(c)中的偶联包括使第一点以及能够偶联至第一分析物和第二分析物两者的第二结合剂；(b)使第一分析物和第二分析物与第一结合剂接触；(c)在(b)之后，使第一分析物和第二分析物与第二结合剂接触；(d)鉴定第一结合剂和第二结合剂；以及(e)使用在(d)中经鉴定的第一结合剂和第二结合[0029]图1A示意性地示出了用于以高度准确方式处理和分析聚合物分析物的示例工作程。图1C示意性地示出了用于使用激活可聚合分子分析聚合物分析物的另一示例工作流了用于分析聚合物分析物的偶联可聚合分子的激活剂的[0030]图2示出了接头的示例，该接头可以用于偶联至可聚合分子和聚合物分析物的单[0039]图11示意性地示出了通过将细胞分区至单独分区中、释放细胞中所含有的蛋白[0040]图12示意性地示出了用于将细胞分区以及将细胞的蛋白质或肽条形码化的示例[0042]图14示意性地示出了用于将组织样品中的蛋白质空间条形码化的另一示例工作[0043]图15示意性地示出了用于将组织样品中的蛋白质空间条形码化的另一示例工作[0044]图16A示意性地示出了使用核酸分子用于证明单体与捕获部分偶联的示例模型系型的捕获部分的偶联。图16C示意性地示出了包含用于偶联核酸分子的接头的底物以及第[0045]图17A示出了对于研究Edman降解处理对第一核酸分子从第二核酸分子的切割事18B示出了用于从肽切割末端氨基酸的示例替代Edman降解方法和此类方法的效率。图18C示出了用于从肽切割末端氨基酸的示例方法以及此类方法的效率的不同定量。图18E示出[0051]图23示出了第二核酸条形码分子在第一核酸条形码分子上的堆叠效率的示例数用杂交链式反应生成包含瓣状序列的可聚合分子的另一示例。图25C示出了杂交链式反应底物结合捕获部分偶联的示例。图25G示出了可聚合分子与底物结合捕获部分偶联的示例[0054]图26A示意性地示出了用于使用包含酶激活剂的结合剂检测单体分析物的工作流给定值的至多±20优选至多±10更优选至多±5并且还更优选至多±1％的范人,Science,242,423_426(1988)，其通过引用并入本文)。(总体上参见Hood等人,Immunology,Benjamin,N.Y.,第2版(1984)以及Hunkapiller和Hood,Nature,323,15_16的水平或更大的亲和力与其同源分子结合。特异性结合相互作用可以涉及第一结合配偶出与大分子的组分或特征的选择性结合(例如，上的分子病理学。空间条形码可以允许对来自组织切片的多个样品或文库进行多重化测核酸链之间的互补程度在经定义的条件下可以对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著胞和/或组织)内的蛋白质空间分布的分析。蛋白质组学可以包括研究蛋白质组的动态状[0085]在肽链的一端具有游离氨基的末端氨基酸在本文中可以被称为“N_末端氨基酸”(NTAA)。在链的另一端具有游离羧基的末端氨基酸在本文中可以被称为“C_末端氨基酸”提供独特标识符标签。UMI可以包括随机序列(例如随机N_mer)。UMI可以用于计数给定细从RNA分子生成的cDNA)。核酸分子衍生物可以展示如起源核酸分子的序列同一性或互补装置产生的和/或从微流体装置流动或由微流体装置施加以涉及经由通过(毛细管)电泳的检测进行测序，在其中一下一代_下一代测序技术。HTS技术是可获得的，诸如由Roche、Illumina和Applied后可以通过使用聚合酶进行扩增在固体底物上的离可以包括对大分子的组分的部分鉴定。例如，蛋白质序列中氨基酸的部分鉴定可以将蛋白通过切割nNTAA，从而将肽的第n_1个氨基酸转化为N_末端氨基酸(在本文中被称为“n_产生新的CTAA。nCTAA的切割将肽的第n_1个氨基酸转化为C_末端氨基酸，在本文中被称为包括关于肽上的翻译后修饰的顺序次序的信息。分析肽还可以包括确定肽中的表位的存在和频率，这可以包括或可以不包括关于肽内的表位的顺序次序或位置的信息。分析肽可以何组合。环加成、四嗪连接以及四唑光点击反应。用于进行点击反应的示例性官能团或反应性柄赖氨酸残基(lysineresidues)、亮氨酸残基(leucineresidue)、亮氨酸残基(leucine的那些类似或等同的方法和材料可以用于本[0110]本公开提供了用于以高度并行和准确的方式处理和分析聚合物分析物的新颖方法。本公开的系统和方法可以与聚合物分析物的子。第一可聚合分子可以包含分析物的识别信息，并且[0112]如本文进一步所描述的，本公开的一种或多种方法可以采用能够偶联至(i)聚合[0114]在本公开的一方面，本文提供了用于处理包含多个单体的聚合物分析物的方法可以包括提供(i)包含多个单体的聚合物分析物和(ii)捕获部分；切割多个单体中的单析物可以具有任何分子量或分子量范围。聚合物分析物可以为约10道尔顿(Da)、100Da、分析物可以包括相似分子量或在分子量范围内的[0117]聚合物分析物的单体可以包括小于整个聚合物分析物大小的任何大小或大小范琼脂糖、聚乙二醇或TentaGelE珠粒)。底物可以是官能化的。一种或多种分子例如捕获分。在一个非限制性示例中，底物(例如，珠粒或表面)可以包含炔，诸如二苯并环辛炔米(mm)或更大。底物的表面积可以包括为约1平方纳米(nm2)、约10nm2、约100nm2、约1,22222221mm2222聚合分子两者都包含点击化学对的一个或多个成员)或酶促地(例如，使用连接酶或聚合酶)连接至第二核酸序列。[0135]可聚合分子可以包括核酸分子，该核酸分子可以包含经修饰核苷酸或非典型碱描述了修饰可聚合分子以使其对某些反应条件更具抗性的其他实可以附加地包含能够直接或间接偶联至捕获部分的第二反应性基团。在直接偶联的示例物，例如氮杂一二甲氧基环辛炔(DIMAC)、对称吡咯并环辛炔(SYPCO)、吡咯并环辛炔团标记并且接头可以包含第二荧光团以能够实现[0142]使用包含两个反应性基团的接头可以允许接头偶联至(i)聚合物分析物的单体和的接头，则在与异硫氰酸酯部分接触期间或之后，氨硫代乙内酰脲基团可以进一步衍生成硫代氨核酸分子的子集可以作为捕获部分，并且多个核酸分子的另一子集可以作为可聚合分子，包含编码信息的附加可聚合分子可以与其偶联。在一些情部氨基酸)。方法可以包括通过偶联接头的氨基酸反应性基团与氨基酸使用包含氨基酸反例中，PITC可以在温和碱性条件下偶联至NTAA以生成NTAA的苯基硫基氨基甲酰基(PTC)衍随加热)实现从肽切割NTAA，以产生噻唑啉酮(ATZ)衍生物或苯基硫代乙内酰脲(PTH)衍生该部分或分子也可以偶联至捕获部分使得氨基酸可以偶并且切割可以通过金属或金属离子的添加来控[0157]在一些情况下，聚合物分析物的单体可以经修饰以促进从聚合物分析物切割单[0158]在一些情况下，包含天然存在修饰的单体可以经处理以去除或改变天然存在修噻唑酮衍生的残基、硫代乙内酰脲衍生的残基等)或经修饰的氨基酸的部分。在一些情况于整个聚合物分析物的任何大小或大小范围中。单体分析物复合物的大小可以为约0.1纳括核酸分子。激活可聚合分子可以经由化学缀合方法与结合剂缀合，例如使用接头诸如亚氨基苯基)丁酸酯(SMPB)、琥珀酰亚胺基一(N一马来酰亚氨基丙酰氨基一乙二醇)酯组合来进行。在一些情况下，可以使用酶促方法将激活可聚合分子缀合至结合剂。例如，或其他酶、核酶或脱氧核酶来生成。在一些情况下，激活可聚合分子可以使用谍标签一可聚合分子与第二可聚合分子或其他可聚合分性酶(例如，连接酶，诸如T4或T7DNA连接酶、环化连接酶(Circleigase)、Taq连接酶、本文所描述的化学缀合方法或经由蛋白质工程化方法，例如生成包含可聚合分子(例如，抗体或抗体片段的可聚合分子与附加可聚合分子的转移或偶联可以通过任何合适的技术个或更多个可聚合分子的序列(例如，空间条形码序列)，该序列独特地鉴定位置合分子的轮次或迭代的循环条形码。随后对第一可聚合分子测序可以用于揭示空间信息15种或更多)。在使用第一和第二结合剂的情况下(例如，结合至第一结合剂的第二结合[0175]在一些情况下，结合剂或底物的钝化可以在与经切割单体接触之前或期间进使用任何有用的方法偶联至彼此。此类偶联可以包括可以通过第一和第二序列分别与夹板或桥连寡核苷酸的第三和第四序列的杂可聚合分子可以例如经由变性或在切割位点切割合分子可以偶联至第一附加可聚合分子，如本文所描述的，并且然后随后切割或去除(例[0180]可替代地或附加地，可以提供多个第一可聚合分子并将其偶联至附加可聚合分从单体捕获部分复合物去除单体可以允许捕获部分可用于后续反应或迭代，或者防止额除检测或转移来自结合剂偶联的可聚合分子的信息之后去除经切割单体的需要中是有用解偶联可以通过使用竞争剂，例如更高亲和力的生物素来竞争性地取代脱硫生物素而实包含鉴定或编码结合剂的可聚合分子的结合剂接触。可聚合分子偶联至附加可聚合分子，核酸分子111偶联至捕获部分105，这可以通过连接核酸分子111与捕获部分105的杂交(杂交未示出)或通过使用包含与连接核酸分子111和捕获部分105的序列互补的序列的夹板寡含可以与捕获部分105的第二反应性部分(未示出)反应可聚合分子107，并且结合剂115和激活可聚合分子123可以去除以重复用于聚合物分析物[0187]图1C图1D示意性地示出了用于使用杂交链式反应(HCR)分析聚合物分析物以生杂交或夹板或延伸反应偶联至一个或多个经切割寡核苷酸B分子，从而生成堆叠的可聚合条形码序列区段包含第一(末端)单体的身份，该合剂115可以包含一个或多个用于鉴定结合剂或其同源分子(例如，单体类型)的可聚合分可聚合分子117可以偶联至包含来自先前轮次或循环或迭代的编码可聚合分子的底物结合合的(第二)可聚合分子可以包含例如使用限制酶或其他切割酶可以切割的限制性位点或间的点击化学环加成反应的产物以生成包含可聚合分子和氨基酸反应性部分的接头分子。可聚合分子201与双官能接头203的缀合可以在任何有用或方便的步骤发生。在替代示例[0196]在使用一个或多个附加可聚合分子的情况下，结合剂的可聚合分子117可以附加序列鉴定(i)氨基酸的身份(例如，二十种蛋白原氨基酸中的任一种)和(ii)循环数(例如，剂)的单链可聚合分子或捕获部分可以使用酶诸如II型限制性核酸内切酶、S1核酸内切酶[0201]可以使用商业上可获得的纳米孔系统(例如，OxfordNanoporeTechnologies、GeniaTechnologies、NobleGen或QuantumBiosyste补物)的可聚合分子117的核酸序列，或获得自多个轮次的结合剂与其靶单体或单体_捕获测序读段，该测序读段鉴定结合剂的可聚合分子117的核酸序列和其中所编码的信息，例以通过读段准确度的概率建模来鉴定错误读段，从而产生具有丢失的或未鉴定的轮次/氨肽读段(重叠群)的可能重构。模型的训练可以可以偶联至捕获部分并从肽经切割。单体_捕获部分复合物可以与包含鉴定结合剂的核酸择性地探测可聚合分子的特定序列。[0210]在一些情况下，个体读取准确度可以通过正确鉴定氨基酸的类或组的概率来表可以各自组成一类氨基酸。氨酸和异亮氨酸)，第二类氨基酸可以包括3种氨基酸类型(例如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨已知的蛋白质组数据库，可以通过模拟从工作流程中的可能的肽集生成的NGS读段来进行基于参考的重构。对于每种可能的肽，模拟可以产生模仿该蛋白质序列系统输出的NGS读考蛋白质数据库使用上下文线索和同源性来鉴定蛋白质，知道X位氨基酸是多个氨基酸中氨基酸或衍生的氨基酸)，使得可以在单一底物上处理不同聚合物分析物(例如，不同的[0216]结合剂文库可以用于识别不同的单体并且有助于高通量结合剂可以能够特异性结合至第一单体分析物并且第二结合剂可以能够结合至第一单体签或通过对偶联至结合剂并任选地转移至底物的可聚合分子测序)可以允许鉴定第一单体[0217]图3示意性地示出了结合剂文库的次序依赖性结合方案，以及如何对特异性较低个单独可寻址单元的可聚合单元或捕获部分可以包括对单独可寻址单元具有特异性的独50％的单独可寻址单元可以包含一个或更少的聚合酸)以及本文所描述的可聚合分子的方法。此类修饰可以例如在使得单体对某些反应条件入本文)中找到。[0226]聚合物分析物或单体可以经修饰以影响结合剂与聚合物分析物或单体的相互作聚合分子的识别信息可以不转移至邻近的可聚合分子，并且因此单体将不被识别为存在。此类阻断或抑制结合剂结合的方法可以有利于对聚合物分析物的单个单体顺序分析，例用任何上述方法增强。例如，PTC衍生的氨基酸可以进一步衍生化为另一形式(例如ATZ或[0232]图48示意性地示出了可以影响结合剂与其偶联的单体或经切割单体的修饰示[0233]图5示意性地示出了衍生化过程或向单体添加化学部分以改变结合剂偶联的示头单体复合物505a可以与特异性识别接头单体复合物505a的结合剂507接触。然后，接头单体复合物505a可以经衍生化以生成衍生的接头单体复合物505b，其不被结合剂507接头501包含氨基酸反应性基团(例如，PITC)，并偶联至肽(未示出)的末端氨基酸(单体包含鉴定或编码结合剂的可聚合分子。结合剂的可聚合分子可以与附加可聚合分子偶联，列)、代表循环或迭代数的序列或其他功能序列。结合剂的可聚合分子可以与偶联至底物单体捕获部分复合物在测序的后续迭代中将不被检或脱氧核酶)与单体(例如，NTAA或CTAA)的亲和力[0238]本公开的组合物可以包含用于处理聚合物分析物或对聚合物分析物测序的任何PhTET氨肽酶、堀越火球菌(P.horikoshii)氨肽酶)、金属酶氨肽酶(metalloenzymaticTSAT(三(琥珀酰亚胺)氨基三乙酸酯)；BS(PEG)5(PEG化的双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯)；BS(PEG)9(PEG化的双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯)；D琥珀酰亚胺(4碘乙酰基)氨基苯甲酸酯)；AMAS(Nα马来酰亚氨基乙酰基氧基琥珀酰亚MBS(m马来酰亚氨基苯甲酰基N羟基琥珀酰亚胺酯)；磺基MBS(m马来酰亚氨基苯甲酰亚胺酯)；LCSPDP(6(3(2吡啶基二硫基)丙酰氨基)己酸琥珀酰亚胺酯)；磺基LCSPDPSE(4叠氮基2,3,5,6四氟苯甲酸,琥珀酰亚胺酯)；ANBNOS(琥珀酰亚胺[4(补骨脂素8基氧基)]丁亚胺(ANBNOS)、N[4(p叠氮基水杨酰氨基)丁基]3'(2'吡啶基二硫基)丙酰胺酯(MBS)、N羟基琥珀酰亚胺4叠氮基水杨酸(NHSASA)、PDPH、N琥珀酰亚胺溴乙酸酯[0256]图8子图B示意性地示出了可以用于将多个分子偶联至底物的多官能接头的示例。多官能接头812可以包括底物拴系基团和一个或多个另外的拴系基团，其可以偶联至可聚[0257]图8子图C示意性地示出了拴系分子的另一示例。类似于拴系分子810，拴系分子814可以包括偶联至捕获部分805的第一结合区域和偶联至另外的捕获部分807的第二结合序列或其他功能序列，其可以排列在第一序列和第二序列之间。拴系基团814可以是单链NHS酯接头将胺官能化的底物与叠氮化物官能化的DNA引物偶联。如本文其他地方所描述接的示例中，使用羧肽酶或酰胺酶用于C一末端官能化(例如，如在Xu等人,ACSChem核酸分子并与诱饵核酸分子杂交)。可以用于官能化或附接的酶的附加示例包括分选酶A、包含伯胺；此类切割可在使胺反应性基团反应之前进行，例如，如由Xie等人Langmuir后单个反应性C末端羧基可以用作单一附接位点的反应性PEG化的肽、甲基丙烯酰胺修饰的肽、马来酰亚胺封端的寡NIPAAM一缀合的肽的迈克尔型[0268]可以将多种类型的分子附接至底物。底物可以包括与其偶联的分子的任何组合，物样品的方法可以包括从生物样品提取或分离一种或多种肽或蛋白质用于进一步处理和200000个条形码。在一些情况下，将条形码加载到分区内，使得每样品种类加载多于约条形码。在一些情况下，将条形码加载到分区内，使得每样品种类加载少于约0.0001、或其他聚合物)对肽或蛋白质加标签。可替代地或附加地，肽或蛋白质可以经富集或经纯使得肽的单独片段可以使用条形码序列与最近邻片段[0287]图11图12示意性地说明了用于处理分区中的细胞样品以获得条形码肽的示例工子集包含单细胞。然后可以用溶解剂处理分区以溶解细胞并将蛋白质从细胞释放至分区个细胞(展示为2x2细胞阵列)的组织样品。[0292]图15示意性地示出了使用3D水凝胶基质用空间条形码将样品中的蛋白质加标签储单元2115、接口2120和外围装置2125通过诸如主板的通信总线(实线)与CPU2105通信。存储单元2115可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。借助于通信接口其可以使得耦合到计算机系统2101的装置能够充当令可以存储在存储位置，诸如存储器2110。指令可以定向到CPU2105，其随后可以对CPU算机系统2101可以与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的示例包括个人电脑[0300]如本文所描述的方法可以通过存储在计算机系统2101的电子存储位置上(例如在[0301]代码可以预先编译和配置，以便与具有适于执行代码的据的形式承载或体现在一种类型的机器可读介质中。机器可执行代码可以存储在电子存储分有时可以通过互联网或各种其他电信网络进行通信。例如，此类通信可以使软件能够从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到和电磁波，诸如通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路在本地装置之间的物理接元2105执行时通过软件的方式实施。算法可以例如去卷积获得自可聚合分子的DNA序列并合至叠氮化物官能化的DNA引物。双层珠粒可以如在Ruiwu等人QSAR&Combinatorial[0315]材料：叠氮化物官能化的DNA引物(IntegratedDNATechnologies)、双层实施例1中所描述的包含DBCO部分和叠氮化物官能化的DNA引物的TentaGelTM珠粒。肽可以PEG3胺溶液以1:1的体积比混合。6.将反应在室温温育过夜中，1(2叠氮乙基)4异硫氰酸苯(本文也称为PITC叠氮化物或叠氮化物PITC)可以用[0345]实施例5——苯胺基噻唑啉酮(ATZ)氨基酸衍生化为苯基硫代氨基甲酰基(PTC)形式物切割单体之后)与包含第一可聚合分子的结合剂接触，并将第一可聚合分子偶联至第二分钟。4.将珠粒重悬浮在连接酶混合物中——对于100uL的反应，在冰上的试管中合并：DNA聚合酶缓冲剂：最终1x组合物为具有NaCl(50mM)、MgCl2(10mM)和DTT(1mM)的Tris合剂接触之后释放单体可以帮助防止在单体分析的后续迭代期间另外的结合剂的下游非的)可以反复进行，直到整个聚合物分析物的全部或一部分被解构并且编码用于使用可聚底物的一个或多个捕获部分或可聚合分子)的多次迭代之后，捕获部分或可聚合分子可被部分包括堆叠的可聚合分子，该堆叠的可聚合分子包括从结合至单体_捕获部分复合物的[0377]下一代测序可以用于鉴定和读取可聚合分子，以确定肽的氨基酸的身份和序如本文所描述的，可聚合分子可以包括偶联至列包含从结合至其靶单体或单体_捕获部分复合物的单独结合剂获得的条形码序列的堆[0381]可以首先通过去除低质量分数读段将实验NGS读段进行预加工，并且然后经由肽[0383]全长蛋白质序列连同异形体和丰度可以使用基于参考的方法或通过从头组装来[0384]从推定肽序列基于参考组装蛋白质序列：基于完整度和长度过滤推定的肽序Trinity(Haas等人,2013)和Plass(Steinegger等人,2019)被适配以使得能够从推定的肽[0386]实施例11——单体经由连接偶联至捕获部分以及单体从捕获部分解偶联的模型[0388]图16A示意性地示出了此类示例模型系统。珠粒底物可以偶联至链寡核苷酸和锚酸(/5Phos//ideoxyU/CTCCCTCTCTTTCTCTCTTTCCCTCTCTCTCCCTTTCTCCCTCCCTCTCCC/3AzideN/)和锚寡核苷酸(/5AzideN/TTCTTCTTCTTCTCCCTCCTCTCTTCT)以1:99的比率提供。[0389]测试了四种不同类型的底物：1)TentaGelTM珠粒(Sigma_Aldrich)、2)双层其可以通过可以使用FWD2和REV引物扩增的在切割位点(诸如限制性位点)使用限制酶或苷酸复合物)用USER@(NewEnglandBiolabs)酶处理以切割链寡核苷酸，并使用qPCR来定量单体捕获部分复合物(链锚寡核苷酸复合物)的数目和剩余的链寡核苷酸的数目。在成功的切割事件中，据预计有很少或没有单[0395]图16D示出了来自此类切割实验的数据，在其中尿嘧啶存在于链并且(i)链寡核苷酸可以成功偶联并连接至捕获部分(由锚寡核苷酸代表)，并且(ii)在应[0398]如本文所描述的，Edman降解方法可以用于从聚合物分析物(例如，肽)切割单体(例如，氨基酸)。标准Edman降解方法可以包括使用升高的温度和强酸，例如三氟乙酸[0400]为确定TC编码的核酸分子在标准Edman降解下是否稳定，如实施例11所描述和图序列。[0401]图17A示出了用于确定(i)在Edman降解(TFA处理)或TE缓冲剂(阴性对照)下TC编码的链和锚寡核苷酸的稳定性，以及(ii)Edman降解是否对从锚寡核苷酸释放链寡核苷酸照)处理四个珠粒群。通过在链寡核苷酸和锚寡核苷酸的引物柄上使用qPCR(使用FWD1和[0408]图18D示出了使用传统Edman降解剂三氟乙酸(TFA)计算切割效率的替代定量方编码的扩增子(Azide一TTCTTCTTCTTCTCCCTCCTCCCTCCCTCTTTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTTTCTCCCTCCCTCTCCC)和TCAG编码的扩增子(Azide一TTCTTCTTCTTCTCCCTCCTCCCTCCCTCTTTCTTTCGCACTGTATCGCACTGTATCTCCCTTTCTCCCTCCCTCTCCC)两者在末端都包含正向引物序列(TTCTTCTTCTTCTCCCTCCT)和反向引物序列(CCTTTCTCCCTCCCTCTCCC)。然后将珠后使用正向和反向引物对珠粒进行qPCR以确定珠粒上存在的D腈切割条件下没有观察到核酸分子的显著降解或破坏，表明此方法作为标准Edman降解的核苷酸，其可以例如经由与捕获部分杂交或使用夹板寡核苷酸偶联至捕获部分中的一个。使用接头，例如(1(2叠氮乙基)4异硫氰酸苯)将模型肽在N末端处另外缀合至珠粒肽联接核酸分子复合物。中的一个和C末端寡核苷酸2223部分杂交。模型肽2203在N末端处还包含联接核酸分子珠粒附接至叠氮化物官能化的DNA捕获分子(/5AzideN/TTCTTCTTCTTCTCCCTCCTCTCTTCT)，5’AAAAAAAAAAAAAGAGAGAAGAGAGGAGGGAGAAGA)、8微升的10xT4DNA连接酶缓冲剂(New的混合物中提供的15皮摩尔的第二模型肽与30微升的1微摩尔夹板寡核苷酸、8微升的10x[0421]Edman降解条件下寡核苷酸的稳定性也可以在局部拴系后测试。对于此类测试条以评估(1)连接的分子的数目，其可以通过可以使用以上所描述的FWD1和REV引物扩增的DNA分子的数目来评估，其中扩增子包括DNA捕获分子和联接核酸(链)分子的至少一部分，[0427]图22C示出了对于未添加连接酶的未连接(未拴系)阴性对照条件的以上概述实验[0429]图22D示意性地示出了使用结合剂对经切割末端氨基酸进行多个轮次的检测。肽能接头和拴系或连接至底物上的捕获部分的联接核如，第二循环(用于分析n1末端氨基酸)的核酸条形码分子可以包含可以仅偶联至具有第[0430]再次参考图22A一图22C中所概述的实验以测试本文中所概述的检测方法的可行[0431]为测试第一轮次捕获部分一条形码复合物的生成效[0437]接下来，进行qPCR以评估1)结合剂条形码向捕获部分转移或拷贝以生成捕获部[0438]图22E示出了对于每个模型肽类型结合剂条形码向捕获部分的第一循环转移或拷子(包含第一结合剂条形码和捕获分子序列)数目的归一化值：1)TMR珠粒与Phe抗体接触[0439]图22F示出了结合剂条形码向第一循环条形码的第二循环转移的qPCR数据。y轴第一循环条形码和第二循环条形码的捕获分子的百分比)。比率中的第一个数字代表对于[0442]图24示意性地示出了使用包含自夹板作用区域的联接核酸分子局部拴系N一末端核酸分子可以包含部分双链区域(例如，发夹)和可以与捕获部分的至少一部分杂交的序[0443]实施例15——第一可聚合分子经由杂交链式反应与激活剂的偶联以及第一可聚[0448]第二组包含相同的第一发夹(H1)分子、相同的激活序列和较长长度的第二发夹[0452]图25E示出了使用不同第二发夹类型的HCR反应的DNA凝胶电泳结果。泳道M表示含模型抗原的磁珠。图25F示意性地描绘了发夹分子中的一个与包含模型抗原的珠粒上的DNA捕获分子的偶联。如本文其他地方所描述的，珠粒可以包含与其偶联的多个可聚合分第一发夹(H1)分子和带有3’瓣状序列的第二发夹分子(H2.3尾)，以达到50nM抗体浓度、素蛋白缀合的小鼠抗接头一Phe复合物抗体和400nM生物素化的激活序列在室温温育一小类型(接头Gly对照或接头Phe)的连接的分子(包含H2.3尾序列和锚分子序列)数目的归HCR是用于生成条形码分子的可行方法，这些条形码分子可以用于偶联至另外的可聚合分氧化物酶，其可以用于将点击化学官能化的酪酰胺偶联至与底物结合的第二可聚合分子，中链霉抗生物素蛋白分子代表包含肽可聚合分子的捕获部分2607)涂覆。提供单体分析物随后可以共价偶联至点击化学(例如，DBCO)官能化的可ThermoFisher)在4摄氏度用在PBS(Teknova)中稀释的重组链霉抗生物素蛋白(A9275，SigmaAldrich)涂覆过夜。然后用PBS洗涤板，并在室温用阻滞缓冲剂(3％BSA)阻断1小抗小鼠二级抗体(B40941Invitrogen)或抗小鼠FcHRP二级抗体(JacksonImmuno，以1:HRP缀合的多克隆山羊抗小鼠二级抗体(Invitrogen)探测时，浓度为0.5微克/毫升的每个合的多克隆山羊抗小鼠二级抗体(B40941高，也表明一级抗体是特异性的，并且使用具有激活HRP的二级抗体导致板中的酪酰胺信号。右侧图表示对于不同浓度单体分析物针对不同二级抗体(Invitrogen“Kit”HRP或后用HRP缀合的多克隆山羊抗小鼠二级抗体(B4[0476]2.如实施方案1所述的方法，其中所所述第一可聚合分子与所述第二可聚合分子[0493]19.如实施方案17所述的方法，其中所述[0497]23.如实施方案8所述的方法，其中所述结合剂间接地偶联至所述第一可聚合分置为促进所述第一可聚合分子与所述第二可核酸分子被配置为偶联至邻近所述第二可聚合分子的附加第二[0502]28.如实施方案26所述的方法，氧化物酶(APEX)，其中所述HRP或所述APEX激活所述第一可聚合分子或所述第二可聚合分所述偶联之前用所述限制酶切割所述第二可聚[0511]37.如实施方案8_36中任一项所述的方[0513]39.如实施方案38所述的方法，其中所述核酸分子包括具有假互补碱基的DNA分[0524]50.如实施方案8_49中任一项所述的[0525]51.如实施方案50所述的方法，其中[0526]52.如实施方案50或51所述的方法[0527]53.如实施方案8_52中任一项所述的方[0529]55.如实施方案53所述的方[0530]56.如实施方案55所述的方法，其[0532]58.如实施方案55所述的方法，其中所[0533]59.如实施方案8_58中任一项所述的方[0535]61.如实施方案59或60所述的方[0537]63.如实施方案61或62所述并且其中(ii)的所述偶联生成所述氨基酸的苯基硫代氨基甲酰基(酰基(PTC)衍生物衍生化以生成噻唑啉酮(ATZ)衍生物或苯基硫代乙内酰脲(PTH)[0541]67.如实施方案66所述的方法，其进一步[0550]76.如实施方案61所述的方法，其中所[0552]78.如实施方案77所述的方法，其中所述[0553]79.如实施方案59所述的方法，其[0570]96.如实施方案8_95中任一项所述的分子包含鉴定所述结合剂或所述氨基酸的条复合物经受足以抑制附加结合剂与所述氨基酸_捕获部分[0575]101.如实施方案8_100中任[0591]117.如实施方案1_116中任一项所[0592]118.如实施方案117所述的方法，其[0593]119.如实施方案118所述的方法，其中所将所述氨基酸偶联至捕获部分以生成氨基酸_捕获部分复合物；(iii)使所述氨基酸_捕获[0597]125.如实施方案124所述的方法[0609]131.如实施方案126所述的方并且进一步包括使用所述瓣状序列以将所述第一可聚合分子偶联至所述第[0614]137.如实施方案135所述的方[0615]138.如实施方案137所述的方法，其进一述第一发夹分子或所述第二发夹分子不同的序列。[0617]141.如实施方案140所述的方[0618]142.如实施方案134所述的方法，其定核酸分子被配置为偶联至邻近所述第二可聚合分子的附加第过氧化物酶(APEX)，其中所述HRP或所述APEX激活所述第一可聚合分子或所述第二可聚合[0629]153.如实施方案126_152中任一项[0633]157.如实施方案154[0635]159.如实施方案153_158中任一案126所述的方法，其中所述第一可聚合分子包括第一核酸分子并且所述第二可聚合分子[0640]165.如实施方案126_164中任[0643]168.如实施方案126_167中任一项所[0645]171.如实施方案170所述的方法[0648]174.如实施方案126_173中任一项所述的方法，其中(c)的所述偶联使用接头介[0653]179.如实施方案177所述的方法，其[0665]191.如实施方案176所述的[0667]193.如实施方案192所述的方法，其中[0668]194.如实施方案174所述的方法，[0673]199.如实施方案126_198中任一项所述的方[0674]200.如实施方案199所述的方[0677]203.如实施方案200_201中任一项所述[0678]204.如实施方案203所述的方法[0679]205.如实施方案204所述的方法，其中[0680]207.如实施方案204_206中任一项所部分或所述第二可聚合分子经由点击化学部分[0707]236.如实施方案126_235中任一项所酸分子包含鉴定所述结合剂或所述单体的序列。分复合物经受足以抑制附加结合剂与所述单体_捕获部分[0713](a)提供(i)所述分析物、(ii)包含激活剂的结合剂、(iii)第一可聚合分子以及[0717]244.如实施方案242所述的方法，[0720]247.如实施方案242_246中任一项所述并且进一步包括使用所述瓣状序列以将所述第一可聚合分子偶联至所述第[0722]250.如实施方案242_249中任一项所述的[0724]252.如实施方案242_251中任一项所述的方法，过氧化物酶(APEX)，其中所述HRP或所述APEX激活所述第一可聚合分子或所述第二可聚合[0728]256.如实施方案242_255中任一项所述[0729]257.如实施方案256所述的方法[0734]262.如实施方案261所述的方法，其中所聚合分子不偶联至所述结合剂；以及(iv)第二可聚合分子，其中所述分析物的大小为<[0741]266.如实施方案263_265中任一项所述的[0744]269.如实施方案263_268中任一项所述的方[0745]270.如实施方案263_269中任一项过氧化物酶(APEX)，其中所述HRP或所述APE[0749]274.如实施方案263_273中任一项所[0750]275.如实施方案274所述的方法，[0755]280.如实施方案279所述的方法，其中[0758](b)使用所述接头以将所述多个氨基酸中的所述氨基酸或另外的氨基酸偶联至所[0762]284.如实施方案283所述的方法，酸分子包含鉴定所述结合剂或所述氨基酸的条形码序列。[0764]286.如实施方案283_285中任一项所[0767]289.如实施方案283_288中任一项[0770]292.如实施方案289_2[0771]293.如实施方案289_292中任其中所述第一可聚合分子和所述第二可聚合分子的所述偶联包括所述第一核酸分子与所[0772]295.如实施方案293所述的方法，其中[0773]296.如实施方案286所述的方第二可聚合分子包含能够与所述第一反应性部分反应的第[0775]299.如实施方案298所述的方法，其中(ii[0791]315.如实施方案282所述的受足以抑制附加结合剂与所述移除的底物偶联氨[0794]319.如实施方案281_318中任一项所述的所述捕获部分经由所述接头偶联至所述氨基酸或所述另[0799]325.如实施方案322_[0802]328.如实施方案327所述的方法，其中所[0804]330.如实施方案327_329中任一项所[0805]331.如实施方案281_330中任一项[0808]334.如实施方案333所述的方法[0809]335.如实施方案334所述的方法，[0810]336.如实施方案333所述的方法，其[0814]340.如实施方案339所述的方法，其分，并且其中(b)的所述偶联包括将所述PIT捕获部分包含能够与所述第二反应性基团反[0829]355.如实施方案354所述的方法，其中[0830]356.如实施方案281_355中任一项[0834]360.如实施方案281_359中任一项所述[0841]367.如实施方案364所述的方法，其[0845]371.如实施方案281_370中任一[0859]385.如实施方案281_384中任一项所述[0860]386.如实施方案281_385中任一项[0861]387.如实施方案386所述的方法，其[0863]389.如实施方案386_388中任一项所述的[0869](d)切割所述末端氨基酸，从而提供偶联至所述底物的经切割氨基酸_接头复合[0875]394.如实施方案392所述的方法，其中其中所述接头包含第二点击化学部分，并且其中(c)中的所述偶联包括使所述第一点击化[0876]395.如实施方案391_394中任一项所述的[0878]397.如实施方案391_396中任一项瓣状序列，并且其中(g)使用所述瓣状序列介导以将所述核酸条形码分子偶联至所述核酸[0882]