DB45-T 2352-2021 猪主要病毒性腹泻防控技术规范

CCSB4145猪主要病毒性腹泻防控技术规范Technicalspecificationofpreventionandcontrolformajorporcineviraldiarrhea广西壮族自治区市场监督管理局发布I前言 12规范性引用文件 13术语和定义 1 1 诊断 5.特点 5.临床症状 325.病理变化 435.实验室诊断 535.结果判定 63 4 7.基本要求 7.疫苗 257.方法 357.仔猪 45 疫情监测 参考文献 13前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出并宣贯。本文件由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。本文件起草人：施开创、冯淑萍、尹彦文、粟艳琼、陈芳芳、屈素洁、陆文俊、莫胜兰、李军。1猪主要病毒性腹泻防控技术规范本文件规定了猪主要病毒性腹泻综合防控技术的诊断、防控措施、免疫预防、疫情监测等要求。本文件适用于广西行政区域内规模猪场猪主要病毒性腹泻的综合防控。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T17824.3规模猪场环境参数及环境管理NY/T1168畜禽粪便无害化处理技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1规模化猪场intensivepigfarm采用现代养猪技术和设施设备，实行自繁自养、全年均衡生产工艺，存栏基础母猪100头以上的养猪场。3.2猪主要病毒性腹泻majorporcineviraldiarrhea由病毒引起的急性消化道传染病，以厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征，其主要病原有猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PDCo：猪德尔塔冠状病毒病（porcinedeltacorona）PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（porcinedeltacoronavirus）PED：猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea）PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）PoR：猪轮状病毒病（porcinerota）PoRV：猪轮状病毒（porcinerotavirus）2TGE：猪传染性胃肠炎（porcinetransmissiblegastroenteritis）TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（porcinetransmissiblegastroenteritisvirus）5.1总则根据疫病的特点、临床症状和病理变化等做出初步诊断，通过实验室病原学、血清学等诊断方法确诊。5.2特点5.2.1概述具有典型的季节性，常发生于春、冬季，对哺乳仔猪造成的危害最为严重，呈现暴发流行或地方性流行。只有一个血清型，不同日龄、品种和性别的猪只均可感染、发病，感染率与病死率随着日龄的增长而下降，以哺乳仔猪感染率与死亡率最高，死亡率50％以上。5.2.3TGE只有一个血清型，对7日龄以内的哺乳仔猪危害较大，病死率70％以上。具有多个血清型，1～4周龄仔猪群，多发于10日龄以内的仔猪，发病率70％以上，病死率7%~只有一个血清型，可引起5～15日龄哺乳仔猪发病，发病率和死亡率均为50％以上。5.3临床症状新生仔猪多发，症状为厌食、呕吐、腹泻、脱水等。发病仔猪颤抖、打堆，出现腥臭味的水样腹泻。随着腹泻的发展，仔猪会因脱水而眼窝下陷、被毛粗乱。部分仔猪腹泻3d～4d后死亡，死前侧卧、四肢划动、口吐白沫。育肥猪、成年猪的临床症状较轻。5.3.2TGE1～7日龄的仔猪主要症状为沉郁、厌食、呕吐、水样腹泻，粪便呈淡绿色或黄绿色，恶臭；患病猪消瘦，运动共济失调。断奶猪、育肥猪及成年猪临床症状较轻，主要为食欲下降或消失，个别猪只出现水样腹泻、呕吐等。发病初期，猪只症状临床症状为沉郁、厌食、不爱走动等症状，部分仔猪吃奶后出现吐奶、腹泻，持续一周以后，脱水严重，体重减轻。成年猪和育肥猪不易发病。3发病猪主要临床症状为严重厌食、腹泻、呕吐、脱水，仔猪致死率高。5.4病理变化消瘦、脱水，胃内有黄白色的凝乳块。小肠肠管膨满扩张、充满黄色和灰黄色液体，肠壁变薄、肠系膜充血，个别猪只小肠黏膜有散在出血点、肠系膜淋巴结肿大。5.4.2TGE小肠黏膜肿胀、潮红，局部附有粘液，部分还有糜烂和溃疡。膀胱黏膜肿胀，有散在出血点。脑膜充血。脑质较软、多汁并有小出血点。胃膨大、扩张，胃黏膜呈暗黑色，胃部可见未消化乳汁和凝乳块。肠道明显鼓气，偶见小肠出现弥漫性充血。胃肠道粘膜损伤，肠壁变薄、松弛，盲肠、结肠扩张。病程严重时出现腹腔、胸腔积水。5.5实验室诊断5.5.1病毒分离与鉴别诊断将PEDV、PoRV疑似样品接种非洲绿猴肾细胞（Vero细胞并对其培养物进行细胞传代培养，通过细胞病变、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、间接免疫荧光（IFA）等方法对传代细胞毒进行鉴定。 将TGEV、PDCoV疑似样品接种猪肾细胞，并对其培养物进行细胞传代培养，通过细聚合酶链反应（RT-PCR）、间接免疫荧光（IFA）等方法对传代细胞毒进行鉴定。5.5.2病原检测样品按照附录A和附录B的方法进行检测。所使用引物、探针序列及扩增目的基因片段序列见附录A、5.5.3抗体检测采集发病初期和发病3周后的血清，使用商品化酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒进行检测。5.6结果判定5.6.1初步诊断流行特点、临床症状和病理变化符合5.2、5.3和5.4，诊断为疑似相应的病毒性腹泻发病猪。45.6.2确诊 6.1猪场应实行预防为主，预防与控制、净化、消灭相结合的方针，加强饲养管理和生物安全措施，做好疫病的综合防控。6.2猪场实行兽医防疫、卫生管理场长负责制。应配备与饲养规模相适应的，具有从业资格的兽医技术人员。定期对猪场员工进行生产技术、疫病防控、生物安全、管理制度等培训。6.3坚持自繁自养，实行封闭式饲养管理。如需引种，应按动物防疫相关要求进行检疫，引进种猪应6.4实行全进全出管理模式。每批猪出栏后均应对猪舍进行严格的清洗消毒，并空栏7d以上方可再次进猪。猪场每年全场应彻底消毒3～4次。6.5猪场应制定完善的消毒制度，并严格执行；猪场入口和生产区入口设置消毒设施，对车辆、人员、物品规范消毒，并做好记录；生产区入口处应配备淋浴设施，人员进入生产区前应沐浴、更衣。6.6猪场的销售展示厅和装猪台应与生产区隔离，设立有车辆、人员独立通道。6.7猪场应安装防鸟、防鼠、防蚊、防蝇网等防护设施，定期灭鼠、灭蚊、灭蝇。6.8设立专用病猪隔离舍，对病猪进行隔离观察。设立独立的兽医室。在远离生产区、下风处建立专门的病死猪无害化处理区。6.9猪场应符合GB/T17824.2的规定，温度、湿度适宜，饲养密度合理，通风良好。应做好季节性降温保暖措施。6.10猪场环境质量控制应按照GB/T17824.3的要求执行。6.12饮用水水质应符合NY/T5027的规定。6.13建立种猪引种、配种、分娩、防疫、免疫、检测、监测、用药、消毒等制度及档案记录。规范记录猪场投入品采购使用、免疫、消毒、检测监测、疫病诊疗、无害化处理、产品销售等，并整理归档。6.14加强投入品管理，不应使用违禁品，不应超剂量、超范围使用抗菌药物，严格执行休药期。6.15饲养员不应互串猪舍。人员进入猪舍前应经消毒池、手部消毒盆消毒。6.16猪场内不应饲养其它动物。员工不应将猪肉、其它动物肉类及其副产品带入场。6.17废弃物应无害化、环保性、资源化循环利用处理。对病死猪及淘汰猪按照NY/T1168处理；粪便、6.18受污染，饲料、垫料、过期或残余疫苗和兽药、一次性养殖用品(如注射器、输液针、输精管等)及包装物等废弃物应集中堆放并进行无害化处理。6.19对确诊的病猪，应加强饲养管理，注意防寒保暖、防暑降温，减少应激因素；补充口服盐水，使用抗病毒中草药和抗菌药物；转移病猪至隔离舍，观察治疗。淘汰弱猪、僵猪、无饲养价值病猪；对淘汰猪、病死猪进行无害化处理。7免疫预防7.1基本要求制定和实施科学合理的免疫程序。57.2疫苗7.2.2疫苗应按说明书要求保存。疫苗稀释后摇匀，并在1h内使用完毕。疫苗瓶不应乱扔，应集中无害化处理。7.2.3应由专人保管、使用疫苗。不应使用无批准文号、过期、变质、失效的疫苗。7.3方法7.3.1后备母猪7.3.2妊娠母猪预产期前40d和15d分别于后海穴接种2头份/头。7.4仔猪免疫母猪所产仔猪断奶后7d～10d于后海穴接种1头份/头；未免疫母猪所产仔猪产后3d于后海8疫情监测8.2加强猪群日常临床观察和监测，及时发现精神不振、采食减少、体温升高、消瘦体弱等异常情况。8.3对出现厌食、呕吐、腹泻、脱水等严重腹泻症状的猪群，选取部分猪只，采集肛拭子和粪便拭子，8.4按4.5.2或4.5.3方法检测，PEDV、TGEV、PDC治疗或淘汰，病死猪按照NY/T1168进行处理。6A.1引物及探针序列见表A.1。序列（5,→3,）A.2重组质粒标准品的构建A.2.1重组质粒构建A.2.2扩增的目的基因片段A.2.2.2扩增的TGEV目的片段7A.3待检样品处理A.3.1组织样品匀浆机或研钵充分研磨捣碎组织样品后，反复冻融3次；以10000×g离心5min，收集上清，用于总RNA抽提，或置-20℃保存备用。A.3.2肛拭子、粪便拭子样品A.4反转录A.4.1反应液总量20μL，在冰浴条件下，在PCR反应管中按下列用量分别加入各成分：——5×RT缓冲液4μL；——灭菌双蒸水：7.5μL。或置-20℃保存备用。反应程序如下：c)95℃反转录酶失活反应5min。A.5.1反应液总量25μL，在冰浴条件下，在PCR反应管中按下列用量分别加入各成分：灭菌双蒸水5.7μL。A.5.2加完试剂后瞬时离心混匀，将PCR管置于荧光PCR仪内，反应程序如下：c)58℃收集荧光信号45sec,40个循环。7判定6质粒标准品混合物为阳性对照，进行扩增反应。当阳性对照反应出现典型S形扩增曲线且Ct循环，阴性对照无扩增曲线或Ct值＞36个循环，实验结果成立。反之，此次检测无效。实验结的判定结果如下：）；）；）；荧光定量RT-PCR产物扩增曲线图9附录BB.1引物序列见表B.1。所扩增目的基因片段序列见B.2。B.2重组质粒标准品的制备B.2.1重组质粒构建态细胞，阳性克隆增菌培养后提取质粒。经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定正确后，所获得重组质粒作B.2.2扩增的目的基因片段序列B.2.2.1扩增的PEDV目的基因片段序列B.2.2.2扩增的TGEV目的基因片段序列B.2.2.3扩增的PoRV目的基因片段序列B.3待检样品处理待检样品处理如下：用；——取200μL待检样品于无RNA酶的1.5B.4.1反转录B.4.1.1反应液总量20μL，在冰浴条件下，在PCR反应管中按下列用量分别加入各成分：——5×RT缓冲液4μL；——灭菌双蒸水7.5μL。B.4.1.2加完试剂后立即离心混匀。将PCR管置于PCR仪内进行反转录，获得的cDNA直接用于多重PCR扩增，或置-20℃保存备用。反应程序如下：c)95℃反转录酶失活反应5min。B.4.2.