DB53-T 1370-2025 滇池高背鲫种质特征基因分子鉴定技术规程

ICS67.120.30CCSB50DB53滇池高背鲫种质特征基因分子鉴定技术规程2025-08-09实施2025-08-09实施IDB53/T1370—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南大学提出。本文件由云南省农业标准化技术委员会(YNTC07)归口。本文件起草单位：云南大学、云南省标准化研究院。本文件主要起草人：罗静、项晴雪、赵杰玉、蒋传娣、于虹漫、严晖、黄典一、冷云、刘仪莲、殷琦丰、殷立京、赵忠。1DB53/T1370—2025滇池高背鲫种质特征基因分子鉴定种质特征鉴定与判定等内容。本文件适用于滇池高背鲫种质的鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18654.3养殖鱼类种质检验第3部分：性状测定GB/T35892实验动物福利伦理审查指南HJ628生物遗传资源采集技术规范(试行)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1分子鉴定moleculardetermination利用核酸技术对生物中细胞核或非核区的DNA或RNA进行长度分析、序列比较，从而区分生物的不同种属。基因组genome一个生物体内所有遗传物质的总和。滇池高背鲫carassiusauratus因物种地和鱼体特别高而得名，属于脊椎动物门(Vertebrata)、硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鲫属(Carassiu)鱼类。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)HI-C:高通量染色体构象捕获技术(High-throughputChromosomeConformationCapture)PBS:磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBufferSaline)2滇池高背鲫学名、分类及生物学特征见附录A,生物学特征测定方法应符合GB/T18654.3的要求。基于遗传学和生物信息学技术，通过分析物种基因组大小及特征进行物种鉴定。7鉴定流程鉴定流程主要为样本采集、流式细胞术实验、流式细胞仪检测与分析、核酸提取、文库构建及测序，最终进行基因组水平的种质特征鉴定，具体流程见图1T3DB53/T1370—20257.2.1采集范围样本采集范围如下：——血液；——成体组织(胸鳍、腹鳍、尾鳍、背鳍、臀鳍、脾脏、肝脏、肾脏、心脏、脑、皮肤、肌肉、肠、眼睛、鳔、鳃、性腺);——胚胎(1K、30ep、GR、Bud、14S、650、pf)。7.2.2采集要求样本采集应符合如下要求：——采集雌性滇池高背鲫与雄性高背鲫各至少尾；——符合HJ628及GB/T35892的相关要求。7.3流式细胞术实验流程7.3.1试剂配制7.3.1.1实验制备试剂材料如下：——抗凝剂-肝素钠(肝素);——鱼用PBS(0.85×PBS)缓冲液；——PI染液；——RNA水解酶；——缓冲液。7.3.1.2PBS和PI工作液具体配方见附录B.1。7.3.2血液样品制备血液样品制备具体方法见附录B.2.7.3.3PI染色PI染色具体流程见附录B.3。7.3.4流式细胞仪检测与分析流式细胞仪检测与分析具体方法见附录B.4。7.4核酸提取及测定7.4.1核酸提取7.4.1.1应采用苯酚/氯仿抽提纯化方法，从成体组织和胚胎样品中提取总DNA,具体流程见附录C.1。7.4.1.2应采用TRIzol和苯酚/氯仿抽提纯化方法，从成体组织和胚胎样品中提取总RNA,具体流程见附录C.2。7.4.2DNA/RNA含量测定7.4.2.1应使用NanoDrop测定DNA/RNA纯度，通过紫外分光光度计测定DNA/RNA溶液在260nm处的吸光值来计算DNA/RNA含量。4DB53/T1370—20257.4.2.2DNA含量测定时，A260/A280的值应在1.8～2.0范围内。7.4.2.3RNA含量测定时，A260/A280的值应在2.0～2.2范围内。7.5文库构建及测序7.5.1文库构建文库构建流程如下：a)DNA片段化：使用超声、酶或者加热的方式将DNA样品打碎成小片段(一般在300bp~800bpb)末端修复：补平片段化导致的不平末端；c)3’末端加“A”:转换为粘性末端并与adapter互补配对；d)接头连接，见以下两种连接方式：1)在fragmentDNA的两端直接加上fullY-adapter,adapter中已经包括了和P5/P7oligo互补的序列、index以及Read1/Read2的测序引物，2)先在fragmentDNA的两端加上PEadapter,然后再引入和P5/P7oligo互补配对的序列以及index序列。e)PCR富集目的片段：调整循环数与投入的DNA量使文库达到上机浓度；f)扩增文库大小质检：使用Agilent2100对文库的insertsize进行检测；g)文库浓度定量，定量方式如下：1)Qubit3.0进行初步定量，2)Q-PCR对文库的有效浓度进行准确定量。7.5.2上机测序上机测序流程如下：a)DNA复制：以寡核苷酸为引物、文库片段为模板；b)解链：将文库片段洗去，与文库模板互补的DNA链留在流通池表面；c)DNA“桥”式扩增：单链DNA另一端与相邻的另一种寡核苷酸互补结合(扩增25个～28个循d)碱基判断：流通池中加入测序引物(Read1SP、DNA聚合酶),清除游离的dNTP,使用激光扫描进行判断；e)下一个碱基测序反应：一个循环结束后加入化学试剂切除叠氮基团和标记的荧光基团，使3/端的羟基暴露，再加入新的dNTP和聚合酶；f)确定DNA文库：Read1结束后，解链并洗掉测序中已经合成的部分，加入测序引物Index引物(即Read2SP互补的寡核苷酸),继续在3’端进行复制，读出接头中Index序列，确定每个位点的DNA属于哪个文库。7.6基因组水平鉴定7.6.1基因组组装及注释基因组组装及注释流程如下：a)通过流式细胞术预测物种基因组大小，通过测序获得基因组测序数据；b)利用上述测序数据进行初步组装得到Contigs数据，再将Contigs数据组装到Scaffold水平；DB53/T1370—20255c)通过补洞软件将基因组进一步组装到染色体水平。7.6.2基因组水平质量评估7.6.2.1保守性基因评估使用基因组水平评估软件对基因组质量进行保守性基因评估。7.6.2.2序列一致性评估使用基因组序列比对软件比对测序reads到基因组，使用bam/sam文件处理工具统计比对情况，比对率在95%以上则说明组装效果较好。7.6.2.3基因组水平注释对滇池高背鲫进行转录组测序，利用成体及不同胚胎发育时期的转录组数据和已发表的其它鱼类参考基因组数据，对其进行基因组结构注释。通过常用的比对软件、常见数据库注释以及保守区域预测等对其进行功能注释。8种质特征鉴定与判定8.1鉴定过程整合待鉴定的滇池高背鲫基因组数据，对其已组装并注释的基因组与四倍体鲫鱼基因组进行比较鉴8.2种质判定通过鉴定基因组的大小及结构是否符合滇池高背鲫基因组特征进行判定，若滇池高背鲫基因组的大小为2.4G～2.6G,且基因组结构与已组装并注释的基因组结构相同，则可判定为滇池高背鲫。6DB53/T1370—2025(资料性)学名、分类及生物学特征的确定滇池高背鲫(Carassiusauratus)。A.2分类地位脊索动物门(Chordata),硬骨鱼纲(Osteichthyes),鲤形目(Cypriniformes),鲤科(Cyprinidae),A.3生物学特征A.3.1外部形态及特征A.3.1.1体色为银灰色基调，背部较深，略呈灰黑色。A.3.1.2腹部较浅，略呈银白色。体较高，头正前位。A.3.1.3吻端位于头尾轴正中。躯体、背腹与头部连接处呈坎状隆起。A.3.1.4背前圆滑，弧度不大，背后较平直，外部形态见图1。A.3.1.5平均1龄鱼重约98g,2龄鱼重约302g,3龄鱼重约488g。图A.1滇池高背鲫外部形态A.3.2可数可量性状鳃耙数为41个~53个，侧线鳞为28片～30片，体长/体高2.28倍～2.49倍，体长/头长3.23倍～3.76倍，头长/吻长3.36倍～4.57倍。7DB53/T1370—2025(资料性)流式细胞术实验流程及倍性确定B.1试剂配制流式细胞术实验试剂配制见表B.1、B.2。表B.1PBS(10×)配方药品表样品质量(g)氯化钠6.4氯化钾磷酸氢二钠磷酸二氢钾双蒸水800表B.2PI染液配方药品表样品质量(μL)PI(1mg/mLRNA酶Trition×100裂解液柠檬酸钠溶液PBS(0.85×)缓冲液B.2.1每一份样品所采集到的鱼个体的生长时间尽量相同(年龄相同),由鲫鱼尾部的倒数第三、四鳞片沿测线鳞向脊柱进针采血，根据个体大小选用适合的注射器，注射器内含浓度为500μL的抗凝剂。B.2.2采样后将血样分为两部分：部分全血保留作流式细胞仪分析倍型。B.2.3另外一部分用离心机分离血浆样品储存在冰箱中(4℃左右)保存以备进行生理生化指标测定。B.2.4对每个采血个体，其体长和体重以及性别都进行测量和记录。B.3PI染色B.3.1草金鱼或鸡等动物的血细胞作为标准对照细胞，使用PBS缓冲液制备成每毫升含1×106个细胞的悬液，将悬液按1:9的比例加到待测鱼细胞中。B.3.2混合后，用0.85×PBS,1000rpm转速离心2min洗1次～2次，弃除上清，细胞沉淀用细胞染液0.5mL(0.85×PBS,0.05mg/mLPI,0.05mg/mLRNAase)轻轻悬浮，常温避光染色10min～15min,或4℃避光染色两个小时。B.3.3测定每个红细胞中DNA含量，以普通红鲫或家鸡的血细胞为参照，计算样品的DNA大小。B.4流式细胞仪检测与分析DB53/T1370—20258B.4.1流式细胞仪检测B.4.1.1选择通道选择靠近荧光染料最大激发波长的激光作为激发光源，选择靠近荧光染料最大发射波长滤光片作为接受通道。B.4.1.2电压使用CS&T电压，同时确认最亮的阳性群信号仍在线性范围内(不超过2×10s)或者阴性群的位置放在200左右(不适用于自发荧光较高的样本),同时确认最亮的阳性群信号仍在线性范围内(不超过2只有大于阈值的信号才能被记录下来，目的是去除碎片及背景信号，除非碎片太多或者检测<500nm的颗粒，否则一般使用默认值。B.4.1.4补偿可以在收取数据调节，也可以在分析数据时调节。B.4.2检测结果分析流式数据为FCS文件，数据分析软件为flowjo、cytobank、FCSExpress等。B.4.2.1直方图横轴为荧光或者散射光强度，纵轴为细胞数。B.4.2.2双参数图横轴和纵轴各代表一个参数，根据需要选择设定。DB53/T1370—20259(资料性)附录C核酸样品(DNA/RNA)样品的提取C.1实验试剂核酸提取实验试剂配制见表C.1～表C.4。样品质量(mM)NaCLTris-HClEDTA200表C.2TE缓冲液配方药品表样品质量(mM)Tris-HClEDTA1样品质量(μL)STE缓冲液450蛋白酶KTris饱和酚600样品质量(μL)TRIzol氯仿200RDD缓冲液DNaseIRNase-freewater高温灭菌DEPC水C.2.1一般情况C.2.1.1取30mg样品，加到450μLSTE缓冲液(pH=8.0)、75μL10%SDS和25μL200mg/mL蛋白酶K中，样品均质化后，置于57℃温箱中消化8～12h至澄清，其间摇匀数次。C.2.1.2待蛋白质消化完毕，加入等体积的水饱和酚或Tris饱和酚(600～700μL,pH=7.8),缓慢混匀抽提20min,小心地混合两相后，于室温9000rpm离心10min,取上清液。DB53/T1370—2025C.2.1.3加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液，缓慢混匀抽提20min,9000rpm离心10min,取上清液。C.2.1.4再加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1),抽提10min,重复两次，每次9000rpm离心10min,取上清液。C.2.1.5加入等体积的异丙醇沉淀DNA,于-20℃静置2h以上沉淀DNA,12000rpm离心10min后，弃上清液。C.2.1.6加入1mL70%乙醇振荡洗涤，除去一些盐分或其他不利于DNA溶解的成分，13000rpm离心10min后，弃上清液(重复两次)。C.2.1.7于室温将DNA沉淀晾干，直至可见痕量乙醇挥发殆