NK细胞培养技术考核试题（含详细答案）

NK细胞培养技术考核试题（含详细答案）适用岗位：细胞培养实验员、免疫细胞制备技术员考核时长：90分钟满分：100分一、单项选择题（每题2分，共20分）1、人体外周血中NK细胞的主要表面标志是（）A、CD3+CD56+B、CD3-CD56+C、CD3+CD19+D、CD3-CD14+2、分离外周血单个核细胞（PBMC）最常用的分离液是（）A、胰蛋白酶分离液B、Ficoll密度梯度分离液C、EDTA分离液D、肝素分离液3、NK细胞体外扩增培养中，核心激活细胞因子是（）A、IL-2B、IL-4C、IL-10D、TGF-β4、无菌细胞培养操作中，超净台开机后需提前紫外消毒的时长至少为（）A、10minB、20minC、30minD、60min5、NK细胞培养过程中，细胞最佳培养温度及CO₂浓度为（）A、36℃，5%CO₂B、37℃，5%CO₂C、37℃，10%CO₂D、36.5℃，3%CO₂6、以下哪种血清最适合免疫细胞无血清培养体系（）A、新生牛血清B、胎牛血清C、人AB血清D、小牛血清7、NK细胞培养后期细胞抱团严重、活力下降，最不可能的原因是（）A、营养耗尽B、细胞因子不足C、传代过密D、培养温度偏低8、细胞冻存时，常规冻存液中DMSO的终浓度为（）A、5%B、10%C、15%D、20%9、NK细胞体外扩增的合理培养周期一般为（）A、3-5天B、7-14天C、15-20天D、20-25天10、检测NK细胞杀伤活性最常用的靶细胞是（）A、Hela细胞B、K562细胞C、293T细胞D、MC38细胞二、多项选择题（每题3分，共15分，多选、少选、错选均不得分）1、影响NK细胞体外扩增效率的因素有（）A、起始PBMC活性B、细胞因子浓度C、接种密度D、换液频率2、NK细胞培养过程中常见的污染类型包括（）A、细菌污染B、真菌污染C、支原体污染D、病毒污染3、以下属于NK细胞生物学功能的有（）A、直接杀伤肿瘤细胞B、分泌细胞因子免疫调节C、杀伤病毒感染细胞D、特异性抗原识别杀伤4、细胞换液操作中，正确的操作要点有（）A、提前预热培养基B、避免液体触碰瓶口外壁C、快速倾倒废液减少暴露D、全程无菌环境操作5、合格的收获期NK细胞需要满足的指标有（）A、细胞活率≥90%B、NK细胞纯度≥80%C、无微生物污染D、细胞形态饱满、分散均匀三、填空题（每空1分，共15分）1、NK细胞全称是__________，是机体固有免疫的核心效应细胞。2、外周血PBMC分离过程中，离心后分层从上至下依次为：血浆层、__________、分离液层、红细胞粒细胞层。3、NK细胞体外培养主要分为__________、激活培养、扩增培养三个阶段。4、细胞培养中支原体污染的典型特征是培养基__________、细胞生长缓慢、形态模糊。5、细胞冻存遵循__________的原则，复苏遵循__________的原则。6、NK细胞培养过程中，常用的细胞激活剂主要为__________及相关激活抗体。7、细胞计数时，计数板四大方格细胞总数为N，细胞悬液稀释倍数为2，最终细胞浓度计算公式为__________。8、无菌操作中，75%酒精主要用于__________和__________的消毒，不可直接用于细胞消毒。9、NK细胞扩增过程中，细胞接种密度过低会导致__________，密度过高会导致__________。10、收获NK细胞前，需对细胞的__________、纯度、活率、无菌状态进行全面检测。四、简答题（每题6分，共30分）1、简述外周血NK细胞分离培养的完整核心流程。2、简述NK细胞培养过程中换液的核心操作原则及注意事项。3、简述细菌污染和真菌污染的细胞培养状态区别。4、为什么IL-2是NK细胞体外扩增的关键细胞因子？5、简述NK细胞收获的标准及终止培养的判断依据。五、案例分析题（每题10分，共20分）1、某技术员进行NK细胞培养，培养第5天观察到培养基轻微浑浊，无明显漂浮菌丝，细胞生长速度明显变慢，镜下可见细胞间隙有细微黑点游动，细胞活率下降至70%左右。请判断污染类型、分析污染原因，并给出应急处理及后续预防方案。2、同一批次PBMC分为两组培养，A组严格按照标准密度接种、按时补加细胞因子，10天细胞扩增倍数达120倍，细胞活率93%；B组起始接种密度过高，未及时补加IL-2，10天细胞扩增倍数仅30倍，细胞大量抱团、碎片增多。请分析B组细胞生长异常的核心原因，并给出对应的优化整改措施。参考答案及详细解析一、单项选择题答案及解析1、B解析：NK细胞特异性表面标志为CD3阴性、CD56阳性，T细胞为CD3阳性，CD19为B细胞标志，CD14为单核细胞标志。2、B解析：Ficoll密度梯度分离液是分离人外周血单个核细胞的经典试剂，可通过密度差异分离PBMC与红细胞、粒细胞。3、A解析：IL-2能够特异性激活NK细胞增殖、分化，维持NK细胞活性与杀伤功能，是NK培养核心细胞因子；IL-4、IL-10、TGF-β均会抑制NK细胞功能。4、C解析：超净台紫外消毒标准时长不少于30分钟，可有效杀灭台面及空气中的微生物，保障无菌环境。5、B解析：人体免疫细胞体外培养标准环境为37℃、5%CO₂，该条件可模拟体内生理环境，维持细胞正常代谢与生长。6、C解析：人AB血清无抗体、无补体，适配人源免疫细胞培养，可避免异种血清的免疫排斥和杂质干扰，是NK细胞培养最优血清。7、D解析：营养耗尽、细胞因子不足、接种过密均会导致NK细胞凋亡、抱团、活力下降；培养温度偏低仅会减慢生长速度，不会直接导致细胞抱团坏死。8、B解析：细胞常规冻存液DMSO终浓度为10%，可有效降低细胞冰点，减少冰晶形成，保护细胞活性。9、B解析：NK细胞体外扩增周期通常为7-14天，此阶段细胞增殖活性最高、杀伤功能最优，周期过长会导致细胞老化、功能衰退。10、B解析：K562人慢性髓系白血病细胞是NK细胞杀伤实验的标准靶细胞，无MHC分子表达，可直接被NK细胞识别杀伤。二、多项选择题答案及解析1、ABCD解析：起始细胞活性、细胞因子浓度、接种密度、换液频率均会直接影响NK细胞增殖速度与扩增倍数。2、ABCD解析：细胞培养常见污染包含细菌、真菌、支原体、病毒污染，其中支原体污染最为隐蔽、危害最大。3、ABC解析：NK细胞属于固有免疫细胞，无特异性抗原识别功能，可非特异性杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞，同时分泌干扰素等细胞因子调节免疫。4、ABCD解析：预热培养基避免细胞温差刺激，无菌操作规范可杜绝污染，快速操作减少细胞暴露时间，均为换液核心规范。5、ABCD解析：合格收获NK细胞需满足高活率、高纯度、无污染、形态正常四大核心标准。三、填空题答案1、自然杀伤细胞2、单个核细胞层（PBMC层）3、细胞分离纯化4、轻微浑浊、无明显沉淀5、慢冻；快融6、白介素2（IL-2）7、N/4×10⁴×稀释倍数8、实验台面；器械外壁9、细胞增殖缓慢、难以扩增；细胞营养不足、抱团凋亡10、扩增倍数四、简答题详细答案1、外周血NK细胞分离培养完整核心流程（1）样本处理：采集外周血，肝素抗凝，无菌环境下用PBS等比例稀释；（2）密度梯度分离：将稀释血液轻柔叠加于Ficoll分离液上层，低速离心分层，吸取中间PBMC层；（3）细胞洗涤：PBS离心洗涤2次，去除分离液、杂质及死细胞；（4）细胞计数接种：调整细胞浓度，接种于专用NK无血清培养基；（5）激活培养：加入IL-2及激活抗体，置于37℃、5%CO₂培养箱激活培养；（6）扩增培养：根据细胞生长状态，定期补加培养基和细胞因子，按需分瓶传代；（7）收获检测：培养7-14天，检测细胞活率、纯度、无菌指标，合格后收获细胞。2、NK细胞换液核心原则及注意事项核心原则：少量多次、保细胞、补营养、稳环境，避免一次性完全换液导致细胞因子流失、细胞应激凋亡。注意事项：（1）培养基提前37℃预热，避免低温刺激细胞；（2）半量换液为主，保留一半旧培养基，维持细胞生长微环境；（3）操作全程无菌，瓶口、器械避免污染；（4）换液时轻柔吹打，避免损伤悬浮NK细胞；（5）换液后及时补充适量IL-2，保障细胞增殖动力；（6）定期观察细胞形态、培养基颜色，异常情况及时处理。3、细菌污染与真菌污染的细胞培养状态区别（1）细菌污染：发病速度快，培养基短时间内快速浑浊、变黄，镜下可见大量游动细小微生物，细胞快速凋亡、碎片增多，细胞活率急剧下降；（2）真菌污染：发病缓慢，初期培养基无明显浑浊，后期出现白色、絮状或丝状漂浮物，镜下可见菌丝、孢子，细胞生长缓慢、抱团老化，污染扩散周期更长，难以彻底清除。4、IL-2为NK细胞体外扩增关键细胞因子的原因（1）静息状态下的NK细胞增殖能力极弱，IL-2可特异性激活NK细胞的增殖信号通路，促使静息NK细胞转化为活化增殖状态；（2）IL-2能够维持活化NK细胞的存活，抑制细胞凋亡，大幅提升细胞扩增倍数；（3）可显著增强NK细胞的肿瘤杀伤活性，维持细胞免疫功能稳定；（4）适配体外无血清培养体系，是目前NK细胞规模化扩增最稳定、必需的核心细胞因子，无替代同源细胞因子。5、NK细胞收获标准及终止培养判断依据收获标准：细胞活率≥90%，CD3-CD56+NK细胞纯度≥80%，培养基澄清、无细菌真菌支原体污染，细胞形态饱满、分散均匀，扩增倍数达标。终止培养依据：（1）培养周期达到7-14天最佳窗口期；（2）细胞增殖速度明显放缓，连续24小时无明显扩增；（3）细胞碎片增多、抱团严重，活率开始下降；（4）细胞杀伤活性检测出现下降趋势，细胞开始老化。五、案例分析题详细答案案例11、污染类型：细菌轻度污染2、污染原因：无菌操作不规范（瓶口污染、器械未彻底灭菌、超净台消毒不达标）、培养基操作暴露时间过长、样本本身带菌等。3、应急处理：立即隔离污染培养瓶，防止交叉污染；轻度污染可加入无菌级抗生素短期处理，密切观察细胞状态；若后续培养基持续浑浊、细胞活率持续下降，直接废弃细胞样本，避免后续实验风险。4、预防方案：严格执行超净台紫外消毒、器械灭菌流程；缩短无菌操作暴露时间；样本分离前严格质检；定期排查培养箱、超净台洁净度，定期清洁消毒设备。案例21、核心异常原因：（1）起始细胞接种密度过高，培养体系营养、空间不足，细胞相互竞争代谢，导致增殖受阻、抱团凋亡；（2）未按时补加IL-2细胞因子，NK细胞