第三节-发酵工程简介

第五章微生物与发酵工程第三节发酵工程简介微生物学的奠基人——伟大的巴斯德(法)我国的传统发酵产品酱油、醋、腐乳等享誉世界我国的酿酒已经有4000多年的历史我国的酱油距今已有3000年的历史1857年巴斯德证明发酵是由于微生物的作用密闭式发酵罐一、谷氨酸发酵的生产实例谷氨酸是味精的主要成分生产谷氨酸可以采用哪些方法?两种生产方式有什么不同?传统生产方式现代生产方式蛋白质水解微生物发酵?植物蛋白氨基酸酶一、应用发酵工程的生产实例谷氨酸发酵（1)菌种：谷氨酸棒状杆菌或黄色短杆菌等（2)培养基：液体（天然)培养基（原料：豆饼或马铃薯等的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素（生长因子)等)发酵罐连续培养控制条件：温度、PH、溶氧量、搅拌（3）发酵过程（4)提取：用Na2CO3中和后，

过滤、分离谷氨酸棒状杆菌是好氧菌图5-14发酵罐的结构示意图电动机pH检测及控制装置培养液无菌空气排气口冷却水出口冷却水进口搅拌器加料口放料口2.培养基的配置豆饼的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素等培养基:碳源:氮源:无机盐:生长因子:培养液（液体培养基、天然培养基)豆饼的水解液、玉米浆尿素磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁生物素1.选择菌种谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌配制好培养液后，是否可以立即加入菌种?

将培养液投放到发酵罐中,通入98kPa的蒸汽进行灭菌用高压蒸汽灭菌法通过高温使蛋白质凝固变性杀死细胞,芽孢和孢子防止种间斗争不能,需要进行灭菌培养过程中不断进行搅拌的目的是什么?使培养液和菌种充分接触,提高原料的利用率二、发酵工程的概念和内容（一)发酵工程的概念采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或者直接把微生物应用于工业生产的一种新技术。

（二)发酵工程的内容包括：菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。

从自然分离的菌种诱变育种基因工程细胞工程生产用菌种扩大培养原料培养基配制接种灭菌发酵罐发酵条件控制分离提纯微生物菌体代谢产物产品流程图:1.菌种的选育要想通过发酵工程获得在种类、产量和质量等方面符合人们要求的产品,最重要的是要有优良的菌种。

怎样才能得到优良的菌种呢?如果生产的是微生物直接合成的产物可以从自然界中先分离出相应的菌种,再用物理或化学的方法使菌种产生突变,从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。

如果生产的是一般微生物不能合成的产品

可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传特性进行定向改造,以构建工程细胞或工程菌,从而达到生产相应产品的目的

2.培养基的配制

要进行发酵生产，有了优良的菌种还需要有与菌种相适应的培养基。在配制培养基时应该注意哪些事情呢?（1)根据不同的菌种，应选择不同的材料配制培养基。配制的培养基应满足微生物在碳源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养要求，并为微生物提供适宜的pH。（2)培养基的营养要协调，以利于产物的合成。（3)培养基在满足微生物的营养需求的基础上应尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。

3.灭菌

发酵工程所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程中不能混入杂菌。这是为什么呢?在发酵过程中如混入其他微生物，将与菌种形成竞争关系，对发酵过程造成不良影响。例如:如果在谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。如果在青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，将合成的青霉素分解掉。

那如何防止杂菌的污染呢?怎样才算灭菌彻底呢?要在发酵前对培养基和发酵设施进行严格的灭菌处理。用高温、高压的方式,杀死所有杂菌的胞体、芽孢和孢子。

4.扩大培养和接种

经过多次的扩大培养。扩大培养是将培养到对数期的菌体分开,分头进行培养,以促使菌体数量快速增加,能在短时间里得到大量的菌体。

如何得到发酵生产所需要的大量菌体来缩短生产周期呢?如何对菌种进行扩大培养呢?5.发酵过程

将菌体接种到装有培养液的发酵罐中，还需要对发酵过程进行检测和对发酵条件进行控制。这是为什么呢?发酵产物主要在菌体生长的稳定期产生。因此,要在发酵过程中随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度以了解发酵进程,及时添加必需的培养基成分来延长菌体生长稳定期的时间,以得到更多的发酵产物。同时,还应对发酵条件进行严格控制。

哪些条件能影响菌体的发酵呢?发酵生产中温度、pH、溶氧量、转速等对发酵过程有重大影响。中心阶段环境中有哪些非生物因素可能影响谷氨酸发酵？温度30-37℃PH7.0-8.0溶氧通气量转速pH呈酸性：乙酰谷氨酰胺;溶氧不足：乳酸或琥珀酸。营养物质的浓度：如C/N＝3：1时，谷氨酸棒状杆菌大量合成谷氨酸;C/N＝4:1时，谷氨酸棒状杆菌菌体大量繁殖，产谷氨酸较少。

控制因素

作用机理

控制方法

温度①影响酶的活性②影响生物合成途径③影响培养基的理化性质以及菌种对营养物质的分解吸收④影响微生物生长

通过控制产热与散热的平衡来控制培养基的温度控制因素

作用机理

控制方法

pH①影响酶的活性②影响细胞膜的带电情况，导致细胞膜通透性改变从而影响对营养物质的吸收和产物的排出③影响培养基营养物质的分解加入缓冲溶液，补加氨水、尿素、CaCO3、NH4HCO3等来控制pH控制因素

作用机理

控制方法

溶解氧①促进需氧型微生物的呼吸②抑制厌氧型微生物代谢通过无菌空气的通气量和搅拌速度来控制控制因素

作用机理

控制方法

泡沫①占据发酵罐的空间②影响通气、搅拌③导致代谢异常安装消泡沫挡板或用消泡沫剂营养浓度直接影响菌体的生长、影响代谢产物的积累、影响代谢途径据具体情况及时控制6、分离、提纯菌体本身,如酵母菌和细菌等代谢产物采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来采用蒸馏、萃取、离子交换等方法进行提取。应用特点生产条件温和原料来源丰富价格低廉产物专一废弃物对环境污染小容易处理等三、发酵工程的应用1.在医药工业上的应用药品抗生素（应用最多，利润最高)维生素动物激素药用氨基酸核苷酸（肌苷)青霉素头孢霉素红霉素四环素复合维生素片

生长素释放抑制因子是一种人脑激素,治疗肢端肥大症,50万个羊脑提取5mg.工程菌:7.5L培养液可得到5mg.基因工程药品人生长激素重组乙肝疫苗单克隆抗体白细胞介素-2抗血友病因子2.在食品工业上的应用①生产传统的发酵产品啤酒、果酒、食醋等②生产食品添加剂添加剂举例酸味剂鲜味剂色素甜味剂L-苹果酸、柠檬酸、乳酸肌苷酸、谷氨酸β-胡萝卜素、红曲素高果糖浆、甜菜糖③解决粮食短缺问题细菌蛋白质占干重的60%-80%酵母菌的占45%-65%单细胞蛋白:通过发酵工程获得的微生物菌体人造肉分为两种，其中一种人造肉又称大豆蛋白肉，它实际是一种对肉类形色和味道进行模仿的豆制品。人造肉主要靠大豆蛋白制成，因为其富含大量的蛋白质和少量的脂肪，所以人造肉是一种健康的食品。另一种是利用动物干细胞制造出的人造肉。研究人员用糖、氨基酸、油脂、矿物质和多种营养物质"喂养”干细胞，让它不断"长大”。

代谢产物生物工程产品五大营养营养协调Ph值适宜成本低

杀死培养基和发酵设备所有杂菌（其他微生物)的胞体、芽孢和孢子。避免种间竞争。如青霉素将培养到对数期的菌体分开,分头进行培养,缩短生产周期

防止污染随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度添加培养基、控制温度、pH、溶氧量、转速蒸馏、萃取、离子交换过滤、沉淀菌种选育:一般有诱变育种，基因工程和细胞工程等培养基配制灭菌:包括设备灭菌和培养基灭菌扩大培养和接种发酵过程:随时了解发酵进程，及时添加必需的培养基组分，严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。

分离提纯菌体：用过滤、沉淀方法代谢产物：用蒸馏、萃取、离子交换等方法扩大培养与发酵生产过程中的培养有何不同呢?

扩大培养是为了让菌体在短时期内快速增殖，而发酵过程中的培养是为了获得代谢产物，目的不同采用的培养条件就有可能不同。

例如：在酒精发酵过程中，扩大培养是为了促使酵母菌快速增殖，因此是在有氧条件下进行。而在发酵产生酒精的过程中则必须在无氧条件下进行以获得大量的酒精。

发酵工程所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程中不能混入杂菌。这是为什么呢?

在发酵过程中如混入其他微生物，将与菌种形成竞争关系，对发酵过程造成不良影响。

例如：如果在谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。如果在青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，将合成的青霉素分解掉。

从自然界分离的菌种产品基因工程诱变育种细胞工程生产用菌种扩大培养原料微生物菌体代谢产物分离提纯发酵罐发酵条件控制接种培养基配置灭菌小结（1)菌种的选育（2)培养基的配制（3)培养基和设备的灭菌（4)扩大培养和接种（5)发酵过程需严格控制温度、PH、溶氧、通气量与转速等发酵条件（6)产品的分离提纯菌体可采用过滤、沉淀等方法分离代谢产物可采用蒸馏、萃取、离子交换等方法提取中心阶段发酵工程内容（诱变育种、基因工程和细胞工程)例题分析[例1]温度对发酵过程的影响，不正确的是（)A.温度过高，发酵周期缩短，产量降低B.温度不影响生物合成的途径C.温度能影响菌种对营养物质的吸收D.菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同[例2](2004陕西)关于谷氨酸棒状杆菌的说法不正确的是（)A.原核生物B.异养型C.需氧型D.次级代谢产物主要是味精DB[例3]发酵工程中能缩短生产周期的方法有()A.连续培养法

B.用稳定期获得的菌种

C.用对数期获得的菌种接种

D.增大接种量ACD例题:右图是人们利用黄色短杆菌合成赖氨酸的途径。请回答下列问题：

⑴黄色短杆菌中含有遗传物质的结构分别是_____和______。

⑵用黄色短杆菌生产赖氨酸，培养基按物理性质分属于___________。

⑶含C.H、O、N的某相对大分子化合物可以为黄色短杆菌提供哪些营养要素物质？_______________

核区质粒液体培养基碳源、氮源⑷由图可知,要增加赖氨酸产量,就必须______________。⑸为了培育新品种,科学家通常采用的方法是_____________。⑹赖氨酸是黄色短杆菌的_________产物,在生产实际中,人们通过黄色短杆菌的培养,大量生产赖氨酸的过程叫__________。

消除高丝氨酸脱氢酶诱变育种初级代谢发酵⑺在黄色短杆菌培养过程中要进行灭菌。灭菌是指杀死一定环境中所有微生物的___________________。⑻在黄色短杆菌培养过程中,如果培养基中的pH发生变化,将影响黄色短杆菌细胞中的_________________________等,从而影响黄色短杆菌对营养物质的吸收。

细胞、芽孢、孢子酶的活性、细胞膜的稳定性(透性)严格控制发酵条件，是保证发酵正常进行的关键，直接关系到能否得到质高量多的理想产物，通常所指的发酵条件控制不包括（)A.温度控制 B.溶氧量的控制

C.pH的控制 D.酶的控制2.生物学家将大肠杆菌的质粒取出，连接上人生长激素的基因以后，重新置于大肠杆菌细胞内，然后用这种带有人生长激素基因的大肠杆菌进行发酵生产人生长激素，该处理过程在发酵中属于A.菌种选育B.扩大培养 C.接种 D.诱变育种

课堂练习:D√3.发酵罐发酵的过程中，使温度升高的热量来源于（)①冷却水供应不足

②微生物代谢旺盛

③培养基不新鲜

④搅拌

⑤放料口排出物A.①②③④⑤ B.②③④ C.①④ D.②④4.下列不属于发酵工程应用的是

（)A.生产抗生素、维生素、药用氨基酸等 B.生产啤酒、果酒和食醋等C.用于化学检测和水质监制 D.生产各种各样的食品添加剂DC5.谷氨酸发酵生产过程中，控制好发酵的条件是十分重要的，下列关于谷氨酸发酵过程中的处理正确的是（)A.提高谷氨酸棒状杆菌细胞膜的通透性，有利于提高谷氨酸的合成速度B.谷氨酸棒状杆菌属于好氧型细菌，发酵过程中应进行通气（无菌空气)和搅拌，以提高培养液中的溶氧量C.控制碳、氮比例为3：1，有利于谷氨酸棒状杆菌的大量繁殖，抑制谷氨酸的大量合成D.在发酵过程中应保持适宜的温度，有利于谷氨酸高效持久的大量合成C6.关于青霉素生产的叙述，正确的是A.青霉素是青霉菌生长代谢中重要的初级代谢产物B.用紫外线、激光、化学诱变剂处理青霉菌再经筛选的方法可以选育高产菌种C.发酵罐接种后必须进行灭菌处理D.在青霉菌生长的稳定期，活菌数不再增加，青霉菌产量也不再增加B.7.下列不需要利用发酵工程的是A.生产单细胞蛋白饲料

B.通过生物技术培育可移植的皮肤C.利用工程菌生产胰岛素

D.工厂化生产青霉素B.

发酵工程:菌种的选育→培养基的配制→灭菌→扩大培养和接种→发酵→分离提纯。

在谷氨酸发酵过程中，如果培养