结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座

结核分枝杆菌核酸检测是检测结核分枝杆菌特异核酸序列；阳性结果提醒该检测结核分枝杆菌核酸存在，在排除核酸污染情况下，可确定该检测标本中存在结核分枝杆菌。结核分枝杆菌核酸检测较常采取目标片段有16SrRNA、IS6110、MBP64、rpoB.hsp65等结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第1页结核分枝杆菌核酸检测

增加分子生物学阳性能够作为确诊标准，及强调病原学检验主要性。3.4.2分子生物学检验结核分枝杆菌核酸检测阳性。4诊疗标准肺结核诊疗是以病原学（包含细菌学、分子生物学)检验为主，结合流行病史、临床表现、胸部影像、相关辅助检验及判别诊疗等，进行综合分析做出诊疗。以病原学、病理学结果作为确诊依据。5.3确诊病例结核分枝杆菌核酸检测阳性，及胸部影像学检验支持即可确诊。

结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第2页惯用技术传统实时荧光定量PCR检测半巢式全自动实时荧光定量PCR检测环介导等温扩增检测实时荧光核酸恒温扩增检测交叉引物恒温扩增检测基因探针检测结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第3页抗酸染色每张检验3-5min或更长时间→阳性率低原因之一荧光染色1.阳性率30%2.无法区分TB

orNTB1.假阳性率高2.结合抗酸染色结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第4页结核菌需要先培养出来（2-6周)再加入不一样浓度抗菌药品培养基中继续培养4-8周汇报药敏结果结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第5页年WHO关于结核诊疗标准肺结核全部患者，包含儿童，当疑似肺结核并可咳痰时，应送2份痰做涂片镜检或1份痰做XpertMTB/RIF检测对于涂阴疑似肺结核患者，应该使用XpertMTB/RIF或培养进行诊疗耐药结核当患者含有耐药结核风险，或者合并HIV感染，或者病情严重时，应使用XpertMTB/RIF做初始诊疗;肺外结核全部患者，包含儿童，怀疑有肺外结核时，应该采集对应样本进行微生物学和组织学检验;优先推荐使用XpertMTB/RIF做初始诊疗结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第6页GeneXpertXpertMTB/RIF一个半巢式实时荧光PCR体外诊疗技术，能够检测结核分枝杆菌以及利福平耐药性；

针对rpoB基因81bp利福平耐药关键区间（RRDR)设计引物、探针。5个探针结合到野生型，而不是突变体目标。每个探针用不一样荧光染料标识，允许同时检测。结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第7页痰标本与处理液1：2混合吸收2ml处理样品到反应盒将反应盒放入检测模块（手工操作完成）标本自动清洗过滤超声裂解DNA提纯DNA和PCR反应试剂混合半巢式实时荧光定量核酸扩增检测打印检测汇报取得检测结果时间：1小时50分钟系统内自动完成结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第8页INH单耐药患者通常不会考虑马上改变治疗方案，与此相反，对RIF单耐药患者，不论INH是否耐药，都会采取与耐多药患者相同治疗方案1。

约90%利福平耐药结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。SvenO.Friedrichetal,.SuitabilityofXpertMTB/RIFandGenotypeMTBDRplusforPatientSelectionforaTuberculosisClinicalTrial.JournalofClinicalMicrobiology.(49):2827-2831.XichaoOuetal.AfeasibilitystudyofXpertMTB/RIFtestattheperipherallevellaboratoryinChina.InternationalJournalofInfectiousDiseases.(31):41-46.MTB/RIF检测对MDR-TB防控"结核+利福平耐药”对多耐结核控制产生效果最为显著。即便补充异烟肼耐药，能提升效果有限。结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第9页环介导等温扩增仪（TB-LAMP)体外定性检测结核分枝杆菌复合群；在恒温条件下进行基因扩增反应；4种引物识别6个区域，特异性高；扩增反应效率高，67℃，40min。主要优点在于对试验室仪器依赖程度较小，而且试剂成本较低。

结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第10页传统实时荧光定量PCR检测目标:定量检测人标本中结核分枝杆菌核酸原理:PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累计实时监测整个PCR进程，最终经过标准曲线对未知模板进行定量分析方法。结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第11页XpertMTB/RIFTB-LAMP结核杆菌DNA目标基因片段rpoBgryB及IS6110IS6110方法半巢式实时荧光PCR环介导恒温扩增实时荧光定量PCR时间2小时1小时2.5小时检测敏感度131菌条/ml100菌条/ml1000～10000菌条/ml优点全自动、同时检测利福平耐药基因、特异性高，生物安全性高67℃恒温扩增，扩增时间短，特异性高，生物安全性高适合大批量筛查，低费用缺点最多一次同时检测八个样本标本用量较少，除痰标本以外标本需深入认证假阳性，易污染，需专业人员操作结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第12页样本类型（一)抗酸杆菌涂片镜检：

痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出脓液、创伤标本、大便标本分枝杆菌分离培养：

痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出脓液、创伤标本、大便标本、血液结核分枝杆菌核酸检测：

痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出脓液、创伤标本、大便标本、血液（GeneXpert除外)、病理切片结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第13页样本类型（二)分枝杆菌菌种判定

临床分枝杆菌分离培养物结核分枝杆菌药品敏感性试验：

临床分离结核杆菌纯培养物结核抗体检测：

血清IFN-γ释放试验（T-SPOT.TB)：

肝素锂或肝素钠抗凝血结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第14页标本留取标准1.痰标本：

（1)可疑肺结核患者：初诊病人应搜集3份标本（当日即时、夜间和次日晨痰)，治疗中或随访病人应按期留取2份痰标本（晨痰、夜间痰)，体积3～5ml，盛于广口和含有螺旋盖子痰瓶中。（2)即时痰采集后马上送检，夜间痰和晨痰采集后常温保留不应超出12小时，对当日不能进行涂片检验标本，须置于4℃冰箱保留，注意预防痰液干涸或污染。（3)对无法咳痰患者：可使用高渗盐水（3%NaCl)诱导痰或搜集清晨胃液标本，或使用支气管镜采集支气管灌洗液标本。结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第15页2．支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本

（1)对于不能留取痰标本患者：推荐使用侵入性采集技术获取标本，比如纤维支气管镜检验、细针肺穿刺、肺活组织检验。

（2)严格器械清洁和消毒，防止引发交叉污染和感染。

（3)支气管镜不能接触自来水，通免污染环境分枝杆菌。

（4)对难以诊疗病例推荐使用其它侵入性技术采集标本，比如细针穿刺、开放肺活组织检验，无菌条件下采集经支气管活检和其它活检标本，运输过程中，应加入0.5～1ml无菌生理盐水。

（5)支气管分泌物最少2～5ml；支气管肺泡灌洗液最少20-50ml。结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第16页3.胃灌洗液（1)婴幼儿、儿童和迟钝者诊疗肺结核时，鉴于无法采集标本或支气管灌洗液，推荐采集胃液标本，经过胃灌洗咽下去痰液。（2)标本应在采集4小时内送到试验室，不然应置于一次性内含100ml碳酸钠酸他无菌容器中。（3)胃灌洗液需连续采集3天，体积5～10ml，调整pH至中性。4.尿液（1)采集标本前，应清洗外生殖器，推荐连续采集3天清晨中段尿于无菌容器中，用于培养尿液标本最少需要40ml（2)只有在不能取得中段尿时，能够使用导尿术采集标本。（3)标本运输不及时，应冷藏保留。结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第17页5.无菌采集体液（脑脊液、胸水、腹水、心包积液、关节液、骨髓)（1)临床医生采取抽吸技术或外科操作无菌搜集体液标本于无菌容器。

结核杆菌DNA及Xpert标本：为预防标本凝固，需加入EDTA抗凝处理（可注入于长紫管中颠倒混匀抗凝处理)。IFN-γ释放试验（T-SPOT.TB)标本：分离淋巴细胞需加入肝素抗凝，抗凝百分比为100ml胸腹水加入0.8ml肝素，颠倒混匀。（2)标本尽可能快运输到试验室（3)应提交足够量样本，脑脊液＞5ml，胸水和腹水5～10ml。结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第18页6．无菌采集组织（淋巴结、皮肤和其它活检标本)

（1)采集标本尽可能无菌操作，放置到无固定剂或防腐剂无菌容器中，不能浸泡在盐水或其它液体或用纱布包裹，重量不少于1g。应快速运输到试验室，对于长时间运输，为预防脱水可加入无菌盐水，保持温度在4～15℃

（2)针对皮肤溃疡，宜从病变组织周围采集活检标本。

（3)福尔马林溶液浸泡过标本不能用于培养检验。

（4)极少许活检标本能够浸泡在少许无菌盐溶液中。结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第19页7.血液（1)假如血液标本接种培养基之前需要运输，肝素成柠檬酸盐能够用于抗凝。EDTA抗凝和凝固血不能做培养。（2)血液和脑脊液标本培养推使且MYCO／FLYTIC瓶（BD)血培养瓶。（暂时不做)8.大便标本

大便标本涂片敏感性只有32％～34％，不能依据涂片结果决定是否进行培养。结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第20页9、病理组织切片（核酸检测)

在一只洁净离心管中加入6-12片5-10μm厚FFPE，勿切白片。

病理组织切片已固定，结核分枝杆菌已无活性，无法做培养。结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第21页DNA扩增技术检测有哪些不足相比DNA检测技术，RNA检测更适合判断病原体转录活性，DNA检测技术不能判断病原体转录活性，不能区分潜伏感染和活动性感染（活动性感染：指示RNA转录活跃，潜伏感染：指示RNA不转录)交叉污染问题变温检测，对仪器要求高抑制反应（Taq酶)结核分枝杆菌的核酸检测专家讲座第22页免疫斑点干扰素释放试验结核菌感染免疫应答反应主要是细胞介导免疫反应；T-SPOT.TB定量检测人外周抗凝全血中受结核杆菌特异混合多肽抗原（ESAT-6和CFP-10)刺激分泌细胞因子干扰素效应T淋巴细胞数量。结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10由结核杆菌基因组RD1区相同操纵子编码蛋白；所以卡介苗菌株均丢失该