CN119506178A 高产核苷菌株的构建方法及其应用 （廊坊梅花生物技术开发有限公司）

本发明提供一种高产核苷菌株的构建方法基因发生起始密码子弱化GTG→TTG(或其他方式使得ccpN编码的蛋白质较野生型相比活性降低)白质没有活性)，使得所述菌株产生核苷的能力2子ccpN的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的核苷生产能来降低所述转录抑制因子ccpN的编码基因的表达或敲除所述转录抑制因子ccpN的编码基5.根据权利要求1_4任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)a)通过改变所述转录抑制因子ccpN的氨基酸b)通过改变编码所述转录抑制因子ccpN的核优选地，弱化是通过如下方式实现的：转录抑制因所述微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)或大肠杆菌(Escherichia9.权利要求1_5任一项所述微生物或权利要求8所述重组菌在核苷或核苷衍生物发酵34[0015]所述微生物可以是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)或大肠杆菌(Escherichiacoli)等。例如，出发菌株为B.subtilis168、B.subtilisA5(菌株苷衍生物发酵生产或提高核苷或核苷衍生物发酵产量中[0033]本发明提供一种枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌，其细胞内编码转录抑制因子ccpN的基因发生起始密码子弱化GTG→TTG(或其他方式使得ccpN编码的蛋白质较野生型相比活性降低)或基因片段缺失(或其他方式使得ccp50.8g/L分别提高至1.1g/L、1.4g/L；突变菌株B.subtilisA0058(ccpNG1T菌株)和中的ccpN进行起始密码子弱化或敲除，分别获得改造菌B.a8429(ccpNG1T菌株)和B.a8430[0036]本发明旨在提供一种利用ccpN突变菌生产嘌呤核苷的方法，其中该微生物中的[0037]研究发现，经过修饰枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的转录抑制因子ccpN(由[0038]ccpN基因弱化或失活，弱化或失活方式包括起始密码子弱化或基因敲除等使得均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,引物序列(5,_3,)acaaaataaggatcctctagaattcttctgtttatttagttcgatcgtactcaAcaccttttcatacatagctatgaagtgaaaaggtgTtgagtagccaagcttgcatgcctgcagggaatccgatacaaaataaggatcctctagaattcttcttgtgaacagggaccgatgtcacctacatagctatgaagtgaaaagggccaagcttgcatgcctgcagtagacgttacaaaataaggatcctctagaaggttctc6tatttaattcgatcgtactcaccaActtttagataaataaacccttccataaagTtgggccaagcttgcatgcctgcagagtctgatactacacaaaataaggatcctctagaaggttctcaataatatgaaccggtattgaggcctttatggaagggtagataaataaacccttccataaaggcctcaagccaagcttgcatgcctgcagagcaggat[0045]以B.subtilis168(野生菌)或一株实验室构建的腺苷生产菌株B.subtilisA5(菌株B.subtilisA5参见CN110257315B)基因组为模板，使用ccpNG1T_1f/ccpNG1T_1r，开大学王淑芳教授惠赠，参见AmarkerlessgenereplacementmethodforB.amyloliquefaciensLL3anditsuseingenomereductionandimprovementofpoly_γ_glutamicacidproduction[J],AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2014,98(21):8963_8973.ZhangW,GaoW,FengJ,etalDOI:10.1007/s00253_014_5824_2)使用XbaI/PstI进行双酶切并进行胶回收。使用组装试剂盒将酶切后的线性化质粒及ccpNG1T[0047]为确定ccpN突变是否能提高鸟苷产量，我们将一株实验室构建的鸟苷生产菌株B.a836(参见CN112574934A)菌株中的ccpN进行突变修饰。以B.a836菌株基因组为模板，得重组质粒pKSU_B8ccpNG1T。转化至B.a836菌株中，筛选获得B8ccpNG1T菌株，命名为7式构建获得质粒pKSU_△ccpN，并将其转化至B.subtilisA5菌株中，获得的菌株命名为B.subtilisA0059和B.subtilis[0051]以B.a836菌株基因组为模板，B8△ccpN_1f/B8△ccpN_1r，B8△ccpN_2f/B8△集菌体，按照试剂盒TakaRaRNAisoPlusCodeNo.9108说明书提取总RNA，按照试剂盒TakaRaPrimeScriptTMRTreag和B.subtilisA0058中pckA的转录水平分别是对照菌株的6.3和6.1倍；工程菌株B.subtilisA0059和B.subtilisA0060中pckA的转录水平分别是对照菌株的8.7和8.6倍；工程菌株B.a8429和B.a430