类鼻疽实验室诊断专家共识

类鼻疽实验室诊断专家共识摘要类鼻疽（Melioidosis）是由类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderiapseudomallei）引起的人兽共患传染病，临床表现多样，易误诊为结核病等疾病，病原体对多种抗菌药物天然耐药，病死率高。近年来我国报告病例显著增加，但实验室诊断能力不均，检测方法应用尚不规范。本共识由中国微生物学会人兽共患病病原学专业委员会和中国医药生物技术协会生物诊断技术分会联合组织专家制定，系统梳理了类鼻疽的病原学特征、实验室检测方法及诊断策略，重点阐述了分子检测等关键技术的规范应用，旨在为临床和实验室提供标准化的诊断指导，提升我国类鼻疽的早期精准诊断能力。关键词类鼻疽；类鼻疽伯克霍尔德菌；实验室诊断；专家共识类鼻疽是一种重要的人兽共患传染病，主要流行于东南亚、澳大利亚北部等热带和亚热带地区，我国海南、广东、广西等南方省份为传统流行区[1]。近年来随着气候变化和人口流动，其全球流行范围呈扩大趋势，我国非传统流行区也已报告本地病例。该病临床表现多样、易误诊，病原体对多种抗菌药物天然耐药，病死率高达20%~50%，对公共卫生构成严峻挑战[2]。建立并普及标准化、高效的实验室诊断方法，对于实现早期识别、指导精准治疗和改善患者预后至关重要。本共识由中国微生物学会人兽共患病病原学专业委员会和中国医药生物技术协会生物诊断技术分会联合组织临床、疾控和检验专家，基于国内外最新研究进展与临床实践制定，旨在为类鼻疽的实验室诊断提供系统化、规范化的指导。1病原学类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderiapseudomallei，BP）为革兰氏阴性需氧杆菌，属于伯克霍尔德菌属，自然腐生菌，主要存在于热带和亚热带地区的潮湿土壤和泥水中。菌体呈短杆状，两端钝圆、浓染，形态类似“回形针”，能产生荚膜多糖，依靠鞭毛运动。BP抵抗力强，耐酸，对营养要求低，可通过破损的皮肤伤口、呼吸道或消化道黏膜侵入人体。BP具有约7.24Mb的庞大基因组，由2条环状染色体组成。其基因含高度重复序列（如TTS1基因簇），利于分子检测靶标设计[3]。基于多位点序列分型（MLST），已鉴定出2311个序列型（ST），基因优势型别分布与地理位置具有一定关联，如亚洲以ST46为主，澳大利亚以ST109常见[4]。MLST分型对BP菌株感染的地理溯源具有潜在价值。BP的致病性与其多种毒力因子有关。III型分泌系统（T3SS）是其核心毒力因子，通过注入BopE、BipD等效应蛋白促进细菌内化、内体逃逸及细胞间传播。研究显示，BP可通过T3SS诱导宿主巨噬细胞发生线粒体自噬，从而逃避免疫应答[5]。此外，脂多糖、荚膜多糖、鞭毛等表面结构协助细菌黏附宿主细胞并抵抗免疫清除；毒素如磷脂酶C、溶血素等则破坏宿主细胞结构，促进细菌扩散。2流行病学特征和临床特点2.1流行病学特征BP主要分布于全球热带和亚热带地区（南北纬20°之间的“类鼻疽带”），包括东南亚、澳大利亚北部、南亚及南太平洋沿岸。我国海南、广东、广西、福建、香港和台湾为传统流行区，近年湖南、浙江等非传统流行区也已报告本地病例，提示其分布存在北移趋势。随着气候变化与人员流动，其分布范围已扩展至非洲、美洲及美国南部等地[1]。发病具有明显季节性，主要集中在夏秋季（8—10月）。暴雨、台风、洪灾等极端天气事件可导致土壤中的细菌扩散至地表，显著增加感染风险[1]。人群分布以中年和老年男性为主，男性发病率普遍高于女性。农民、建筑工人、渔民等因职业需频繁接触土壤或水体，感染风险显著升高。传播途径主要经皮肤接触污染的土壤或水体传播，尤其在皮肤存在伤口时；其次为吸入含菌气溶胶或经消化道摄入污染水源。糖尿病、慢性肾病、慢性肺病、恶性肿瘤等基础疾病，以及长期使用免疫抑制剂、酗酒等导致免疫功能低下的人群，为类鼻疽感染的高危人群[1]。据模型估算，全球每年约发生16.5万例类鼻疽病例，导致8.9万例死亡，疾病负担（以DALYs计）已超过登革热、钩端螺旋体病等热带病[1]。2.2临床特点类鼻疽临床表现极为多样，缺乏特异性，可表现为无症状感染、局部脓肿或暴发性脓毒症[1]。肺炎为最常见表现（50%~60%），影像学可见坏死性肺炎伴空洞形成，易误诊为肺结核。脓毒症是最严重的临床类型，病死率可高达40%~70%，常起病急骤，易发展为感染性休克及多器官功能衰竭。肝脓肿、脾脓肿及前列腺脓肿较为常见，亦可累及神经系统（脑膜炎、脑脓肿）和骨关节（化脓性关节炎、骨髓炎）[3]。类鼻疽复发率为4%~23%，多因抗菌疗程不足所致。潜伏感染可于数十年后因免疫抑制等因素被激活[3]。3实验室检测类鼻疽的实验室诊断需结合临床表现与流行病学史，遵循规范化的检测流程。细菌培养仍是确诊的“金标准”，分子检测技术发展迅速，血清学检测主要用于辅助诊断与流行病学调查。3.1标本采集、保存与运输应根据感染部位采集相应标本，包括血液、痰液或支气管肺泡灌洗液、脓液或伤口分泌物、尿液、脑脊液、穿刺液、关节液及组织标本等。血标本是进行细菌培养最重要的标本类型，因菌血症在类鼻疽中十分常见。此外，对所有疑似病例均推荐采集喉拭子、直肠拭子及尿液离心沉淀物进行培养[6]。疑似脓毒症患者应在使用抗菌药物前采集多套血培养；疑似肺炎患者优先采集支气管肺泡灌洗液或深部痰液；局部感染应采集足量脓液或组织标本。标本应尽快送检，若需长时间运输，应使用适宜的转运培养基并在4℃条件下保存，运输时限建议不超过24h。3.2病原菌分离、鉴定与药敏试验推荐使用血琼脂、巧克力琼脂及含庆大霉素和结晶紫的Ashdown选择性培养基，于35℃~37℃培养至少48h。涂片染色是快速初步识别BP的重要手段，革兰染色可见革兰阴性杆菌，亚甲蓝染色可见菌体呈“回形针”状（中间淡染、两端浓染），该特征具有较高的提示价值。BP在Ashdown培养基上可形成典型紫色、干燥、皱褶菌落。其为需氧革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类，精氨酸双水解酶阳性，42℃可生长。使用API20NE或自动化鉴定系统（如VITEK、迪尔、美华）及MALDI-TOFMS可进行准确鉴定，但需注意与鼻疽伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌等相近菌种鉴别[1]。乳胶凝集试验通过检测BP荚膜多糖抗原，可在数分钟内实现菌落快速鉴定，特异度高，适用于资源有限实验室[7]。分离出BP后，其药敏试验可作为临床治疗参考。BP对氨基糖苷类、大环内酯类及多肽类等多种抗菌药物天然耐药，该天然耐药谱本身对菌种鉴定具有重要提示价值。临床经验用药应覆盖头孢他啶、碳青霉烯类（亚胺培南或美罗培南）、复方磺胺甲噁唑及多西环素。推荐采用微量肉汤稀释法或Etest法检测最低抑菌浓度（MIC）。需注意，目前常用的商品化药敏卡片多无法一次性覆盖CLSI指南推荐的全部药物，建议联合使用两种或以上卡片以确保药敏结果的完整性；对于重复分离株（尤其间隔超过1周），应重新进行药敏试验以监测压力性耐药[1]。根据《人间传染的病原微生物目录》（2023年版），BP危害程度归类为第2类。疑似标本的常规检测（如涂片染色、培养、鉴定）应在BSL-2实验室中进行；涉及大量活菌操作时应按照第2类病原微生物的管理要求，在相应生物安全级别实验室中加强防护。分离获得的BP菌株应按国家规定进行登记、上报和保藏管理。实验活动结束后，应在6个月内将菌（毒）种就地销毁或送交保藏机构保管；销毁应在相应生物安全级别实验室中进行，由2人共同操作并严格监督，销毁全过程须详细记录，相关记录保存不少于20年。3.3分子检测分子检测技术因其快速、高灵敏度及高特异性等特点，已成为类鼻疽实验室诊断体系的重要组成部分。各类分子检测方法的靶基因、技术特点、方法学评价及推荐意见详见表1。3.3.1常规PCR与实时荧光定量PCR（qPCR）用于类鼻疽诊断时，推荐靶基因为BP的TTS1基因簇（多拷贝，灵敏度高）或BPSS0083等保守序列。qPCR可在2~3h内完成检测，适用于血液、BALF、脓液等临床标本的快速筛查。对于疑似脓毒症患者，qPCR检测血液标本中BP核酸的灵敏度可达传统培养的2~5倍，尤其适用于已使用抗菌药物后血培养转阴的病例。对于肺炎患者，BALF标本的qPCR阳性率显著高于痰液标本。具体引物和探针序列可参考Novak等建立的TTS1-orf2qPCR方案[8]。3.3.2微滴数字PCR（ddPCR）ddPCR是一种新兴的核酸绝对定量技术，通过将反应体系分割为数万个微滴进行独立扩增，实现靶标核酸的绝对定量，无需依赖标准曲线。研究表明，基于微滴数字PCR的多重检测方法可同时检测包括BP在内的5种生物威胁病原体，检测限达0.1~1.0pg/μL，在模拟土壤样本中的检测灵敏度显著优于qPCR（检出率100%vs65.71%），且不依赖标准曲线即可实现绝对定量，在低载量样本检测中具有独特优势[9]。该方法尤其适用于低菌量感染、抗菌药物使用后培养阴性的病例，以及需要精确评估细菌载量的临床场景。3.3.3环介导等温扩增（LAMP）用于类鼻疽诊断时，靶基因首选TTS1-orf2、groEL等多拷贝序列。LAMP的优势在于无需热循环设备，仅需恒温水浴锅或金属浴即可完成扩增（通常63℃、60min内完成），结果经羟基萘酚蓝等染料显色后可肉眼判读，非常适用于我国海南、广东等基层疾控机构和县级医院的现场快速筛查。研究表明，Klayut等建立的羟基萘酚蓝可视化LAMP检测BP的TTS1-orf2，DNA检测限为185fg/μL；血液、痰液和尿液模拟染菌标本的检测限为208CFU/mL；以191份临床标本进行评价，其灵敏度为97.96%（48/49）、特异度为100%，与培养法一致性良好（κ=0.99）[10]。在类鼻疽流行区，LAMP可作为疑似病例的一线快速筛查手段，阳性结果结合流行病学史和临床表现即可启动早期治疗，无需等待培养结果。具体引物序列可参考Klayut等建立的LAMP检测方案[10]。3.3.4多重交叉置换扩增（MCDA）用于类鼻疽诊断时，MCDA结合纳米生物传感器可实现可视化快速检测，检测限为100fg，特异性100%，适用于现场及临床实验室快速检测[11]。该技术操作简便，结果可通过肉眼判读，对于缺乏荧光定量PCR设备的基层实验室具有较好的适用性。3.3.5CRISPR/Cas检测系统用于类鼻疽诊断时，基于CRISPR/Cas系统的检测技术通过特异性识别和切割靶标序列，耦合信号放大策略可实现超高灵敏度检测。最新研究表明，通过系统性的crRNA设计（五联crRNA策略），CRISPR-Cas12a检测平台的检测限从既往报道的100pmol/L降至7.5pmol/L；在此基础上采用结构优化的发夹探针，无预扩增条件下检测限进一步降至2.1pmol/L，信噪比提升42倍，响应时间从56min缩短至3min；经RPA预扩增后检测限可进一步降至14.82copies/μL，为BP的精准鉴定提供了新兴技术手段[12]。此外，基于CRISPR/Cas14a的电化学生物传感器结合纳米酶信号放大，检测限低至12.8amol/L，可用于BP的超高灵敏度检测[13]。该技术目前仍处于研究阶段，建议在条件具备的实验室开展。3.3.6宏基因组测序（mNGS）mNGS直接对临床样本中全部核酸进行高通量测序，无需预设靶标，覆盖范围广。在类鼻疽诊断中，尤其适用于以下情形：（1）培养阴性但临床高度疑似的疑难病例，患者常在采血前已经验性使用抗菌药物，mNGS可不受抗菌药物使用影响直接检测BP核酸。已有研究报道，mNGS在血培养阴性的类鼻疽脓毒症患者中成功检出BP序列，为早期诊断和靶向治疗提供了关键依据[14]；对于不明原因发热（FUO）患者，mNGS在脾脏活检标本中检出BP核酸，确诊了慢性脾类鼻疽[15]。（2）混合感染或罕见部位感染（如脑脓肿、肝脓肿），mNGS可同时检测多种病原体。（3）非流行区输入性病例的快速识别，有研究报道北京一例输入性类鼻疽病例，mNGS在支气管肺泡灌洗液中快速检出BP，显著早于培养结果，并通过全基因组SNP系统发育分析完成溯源，确认感染来源于泰国[14]。局限性包括人源宿主核酸背景干扰高、BP与其他伯克霍尔德菌属的序列同源性可能导致种水平鉴定困难、检测成本较高等，结果需结合临床综合判读。3.3.7靶向测序（tNGS）tNGS通过多重PCR或探针杂交富集目标病原基因组特定区域后进行高通量测序，有效降低人源背景干扰，提高检测灵敏度和特异性，约14~26h出结果。针对类鼻疽，tNGS可靶向富集BP保守序列（如TTS1、BPSS0083等），显著提高低载量样本的检测灵敏度。已有病例报道显示，tNGS在非疫区类鼻疽病例中成功检出BP（序列数334reads，载量282copies/mL），为确诊提供了关键依据[16]。tNGS还可同步检测耐药基因与毒力因子，经济性优于mNGS，适合临床常规开展。局限性包括检测范围受限于panel设计，目前针对类鼻疽的商品化panel较少。3.4血清学检测血清学检测在类鼻疽诊断中主要用于暴露风险评估、流行病学调查及非流行区病例的辅助诊断。间接血凝试验（IHA）技术成熟，成本较低，可提供半定量结果，但其临界值判定可能因地区而异，且在流行区因人群背景抗体阳性率高，特异性不理想[1]。酶联免疫吸附试验（ELISA）可使用灭活的全菌、纯化抗原或重组蛋白（如Hcp1、GroEL1、AhpC等）作为包被抗原，其敏感性和特异性可分别高达98.4%及95.1%，更易于标准化和自动化，适用于大规模筛查[1]。侧流免疫层析检测（LFI）操作简便快速（约10~15min），无需特殊设备，适合现场快速筛查（POCT）和资源有限地区；研究发现其检测尿液标本中荚膜多糖（CPS）的阳性率（40.5%）显著高于血清标本（6.5%），表明尿液是更理想的检测基质[8]。免疫荧光检测（IFA）可使用BP菌体或重组抗原，检测IgG时特异度可达100%，但操作复杂，需荧光显微镜和专业判读[1]。急性和恢复期双份血清动态检测有助于辅助判断活动性感染。总体而言，在流行区，血清学检测更适用于排除诊断，其结果应结合培养、分子检测及临床表现综合评估，不能单独作为确诊依据[1]。3.5检测策略推荐对疑似类鼻疽患者，应尽早采集血液及其他感染部位标本进行细菌培养。推荐使用qPCR或LAMP等方法对临床标本进行快速分子筛查。对培养阴性但临床高度疑似的病例，建议采用mNGS/tNGS进行检测。血清学检测结果需谨慎解读，应结合培养、分子检测及临床表现综合判断。单次血清学阳性可能仅反映既往暴露。具体诊断流程见图1。4诊断策略与病例定义结合类鼻疽的临床和实验室特点，建议按以下3类进行病例分类，以指导临床医师和实验室人员的诊断实践。本病例分类参考了2022年《类鼻疽诊断与治疗专家共识》的相关内容，并结合实验室检测方法的发展进行了补充。4.1疑似病例在类鼻疽流行或高发地区，对于感染性发热患者，有以下情况之一者应考虑疑似类鼻疽：（1）有相应的高危因素（糖尿病、慢性肾病、酗酒、免疫抑制等），特别是在台风、暴雨后出现急性脏器脓肿（如肺、肝、脾、前列腺、腮腺脓肿）；（2）有高危地区旅居史，出现不明原因发热、合并脓肿的患者；（3）临床表现为不明原因肺炎、多发脓肿或脓毒症，常规抗感染治疗无效者。4.2临床诊断病例疑似病例具备以下条件之一者，可考虑为临床诊断病例：（1）有明确的流行病学暴露史（疫区居住或旅行、接触污染土壤或水体），同时具备典型的临床表现（肺炎、多发脓肿、脓毒症等）；（2）恢复期血清特异性抗体滴度较急性期呈4倍及以上升高；（3）影像学检查提示典型脓肿特征（如肝脓肿“蜂窝征”）。4.3确诊病例临床诊断病例或疑似病例，具备以下条件之一者，可确诊为类鼻疽：（1）临床标本（血液、痰液、脓液、尿液等）培养分离出BP；（2）临床标本经qPCR或LAMP等方法检测BP特异性核酸阳性；（3）mNGS或tNGS检测到BP特异性序列且序列数达到判定阈值。凡不符合上述疑似病例、临床诊断病例及确诊病例判定标准者，列为排除诊断。5总结与展望类鼻疽临床表现多样、诊断困难，实验室检测是确诊的关键依据。本共识系统梳理了类鼻疽的流行病学特征、实验室检测方法及诊断策略，强调在保持细菌培养作为金标准的基础上，积极推进分子检测技术的规范化应用。涂片染色作为快速初筛手段应得到重视，qPCR和LAMP适用于快速筛查，mNGS和tNGS为疑难病例提供了新的诊断途径。需要重申的是，所有涉及活菌的操作必须在BSL-2及以上实验室进行，严防实验室感染。未来应重点关注以下方向：（1）开发高敏感性的多重检测技术（如类鼻疽与结核联检试剂）；（2）建立标准化的实验室检测流程和质量控制体系；（3）推进数字PCR、CRISPR/Cas等新技术在类鼻疽诊断中的临床转化；（4）完善全国性监测网络和预警系统。通过多学科协作和区域联防联控，提升我国类鼻疽的精准诊断和有效防控能力。参考文献：[1]MeumannEM,LimmathurotsakulD,DunachieSJ,etal.Burkholderiapseudomalleiandmelioidosis[J].NatRevMicrobiol,2024,22(3):155-169.DOI:10.1038/s41579-023-00972-5[2]MadhurantakamS,KarnamJB,DhamuVN,etal.ElectrochemicalimmunoassayforcapturingcapsularpolysaccharideofBurkholderiapseudomallei:earlyonsitedetectionofmelioidosis[J].ACSInfectDis,2024,10(6):2118-2126.DOI:10.1021/acsinfecdis.4c00133[3]HaydenHS,LimR,BrittnacherMJ,etal.EvolutionofBurkholderiapseudomalleiinrecurrentmelioidosis[J].PLoSOne,2012,7(5):e36507.DOI:10.1371/journal.pone.0036507[4]GodoyD,RandleG,SimpsonAJ,etal.Multilocussequencetypingandevolutionaryrelationshipsamongthecausativeagentsofmelioidosisandglanders,BurkholderiapseudomalleiandBurkholderiamallei[J].JClinMicrobiol,2003,41(5):2068-2079.DOI:10.1128/JCM.41.5.2068-2079.2003[5]NanD,RaoC,TangZ,etal.BurkholderiapseudomalleiBipDmodulateshostmitophagytoevadekilling[J].NatCommun,2024,15(1):4740.DOI:10.1038/s41467-024-48824-x[6]WiersingaWJ,VirkHS,TorresAG,etal.Melioidosis[J].NatRevDisPrimers,2018,4:17107.DOI:10.1038/s41572-018-0002-y[7]DuvalBD,ElrodMG,GeeJE,etal.EvaluationofalatexagglutinationassayfortheidentificationofBurkholderiapseudomalleiandBurkholderiamallei[J].AmJTropMedHyg,2014,90(6):1043-1046.DOI:10.4269/ajtmh.14-0025[8]NovakRT,GlassMB,GeeJE,etal.Developmentandevaluationofareal-timePCRassaytargetingthetypeIIIsecretionsystemofBurkholderiapseudomallei[J].JClinMicrobiol,2006,44(1):85-90.DOI:10.1128/JCM.44.1.85-90.2006[9]DuY,YanZ,SongK,etal.Developmentandevaluationofamultiplexdropletdigitalpolymerasechainreactionmethodforsimultaneousdetectionoffivebiothreatpathogens[J].FrontMicrobiol,2022,13:970973.DOI:10.3389/fmicb.2022.970973[10]KlayutW,AramrueangP,PhetsuksiriB,etal.Hydroxynaphtholblue-basedloop-mediatedisothermalamplificationfortherapiddetectionofBurkholderiapseudomallei[J].TransRSocTropMedHyg,2025,119(10):1177-1183.DOI:10.1093/trstmh/traf053[11]WangX,WangL,ZhuH,etal.ReliabledetectionofBurkholderiapseudomalleiusingmultiplecrossdisplacementamplificationlabel-basedbiosensor[J].BMCMicrobiol,2022,22(1):72.DOI:10.1186/s12866-022-02485-2[12]WangH,WangZ,WuM,etal.CrispHunter-enabledsystematiccrRNAdesignandstructure-optimizedhairpinprobesforenhancedCRISPRCas12adetectionofBurkholderiapseudomallei[J]