多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

1、,课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段,1、多聚酶链式反应的概念：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术,2、多聚酶链式反应的应用：的诊断、和DNA等各方面。,遗传疾病,刑侦破案,古生物学,基因克隆,序列测定,1、DNA分子的组成成分和结构,DNA分子的基本组成单位是.共有种,每个基本单位是由一分子的、一分子的、和一分子的构成。,脱氧核苷酸,4,磷酸,碱基,脱氧核糖,？,那么DNA分子的平面结构怎样呢？,二、基础知识,A,G,C,T,1、DNA的基本单位脱氧核苷酸,2、DNA分子的平面结构,5端,3端,识别：DNA分子的3端与5端-OH端为3;磷酸基团的末端为

2、5。,3、总结：胞内DNA复制的基本体系,打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,解旋酶,DNA母链,4种脱氧核苷酸,DNA聚合酶,引物（RNA）,打开DNA双链,模板,合成子链原料,催化子链合成,使DNA聚合酶能从引物3端开始连接脱氧核苷酸,思考：3、体内DNA复制的条件是什么？体外扩增DNA如何提供相似环境？,变性（80-100）,Taq聚合酶（耐高温）,2030个核苷酸构成DNA或RNA,DNA双链反向平行,3,5,5,3,DNA聚合酶能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。,

3、DNA双链,单链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,一、PCR原理,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物和引物与两条单链的结合,一、PCR的原理（PCR的技术原理）,时间（min）,温度,（）,适温延伸,高温变性,低温复性,重复13步30轮,步骤：变性复性延伸,PCR反应需提供的条件,缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。,（1）PCR循环-变性,95变性,（1）PCR循环-变性,95变性,（1）PCR循环-变性,95变性,（2）PCR循环复性,55复性,（3）PCR循环延伸,

4、（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,二、PCR的反应过程,变性95oC,5,引物1,5,引物2,5,5,模板DNA,2530次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。,4、循环特点：,PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性、延伸三步。结果子代DNA中有最初母链的只两条（无引物存在于两个子代DNA分子中）。其它子代DNA分子都为双引物分子式从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，处于两

5、引物之间的DNA序列呈指数增长12N,体内DNA复制与PCR的技术区别：,三、PCR反应的实验操作,1、PCR仪,设备及用具,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次,实质上一台能够自动调控温度的仪器,三、PCR反应的实验操作,（1）（准备）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（2）（移液）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（3）（混合）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（4）（离心）将微量离心管放在离心机上（5）（反应）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序,四、操作提示：,操作

6、提示1为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。2PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。,目的：,避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。,五、结果分析与评价,1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰

7、(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。,2、过程,稀释,2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零,取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值,测定并计算,DNA含量（g/mL）50(260nm的读数)稀释倍数,五、结果分析与评价,DNA含量的测定：稀释对照调零测定计算（公式见P63）,波长260nm处读数,蒸馏水做对照,50倍,六、课题延伸,1、PCR优点：2、PCR技术的应用P58,原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作,练习(课

8、堂检测),1、DNA单链的_末端为3端,_末端为5端,在DNA复制时,引物从模板链的_端配对结合.在_酶的作用下,从引物的_端,使子链向下延伸.2每次循环可以分为_这三个过程,对应温度分别为_.,磷酸基团,羟基,羟基,DNA聚合,3/,变性、复性、延伸,95、55、72,90以上、50左右、72左右,练习(教材P63),1、一个DNA片段经过30次循环后能形成_个这样的片段.2、依据DNA吸收紫外光的情况,用紫外分光光度计测得DNA=_,230,50 x(260nm的读数)x稀释倍数,课堂小结,练习巩固,1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定,2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？,3、P