细胞转染技术

1、细胞转染技术,一：转染的简介二：转染的分类三：转染的方法,一、转染的简介,1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。转染的DNA：cDNA,基因组DNA，有目的基因的质粒DNA。2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。不表达表达；表达不表达,二、转染的分类,基因转染真核细胞的方法,是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时转染，但用于稳定转染却不可靠。,DEAE-葡聚糖法,磷酸钙共沉淀转染法,由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时

2、转染和稳定转染的研究。原理是，先将外源性DNA和氯化钙混合，然后加入到含磷酸离子的缓冲液，在特定PH下（通常PH7.1），慢慢形成DNA-磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞中，培养一段时间后，通过胞膜的内吞作用摄入DNA。,脂质体介导法（目前应用最广泛）,原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。,【主要应用】:瞬时转染稳定转染.【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有

3、免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。,利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。,物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪),（1）电穿孔法利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有

4、效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。,(2）显微注射法该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。（3）基因枪法该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。,实验室用到的转染方法,脂质体介导法,细胞转染以Lipofectamine2000转染试剂为例：转染前一天，将细胞铺到6孔培养板中，加入有血清无双抗的培养基（2ml）；24小时换上无血清无双抗的培养基2ml；将2g的质粒用375L无血清无双抗的培养基稀释；取12L的Lipofectamine2000加入375L无血清无双抗

5、的培养基稀释；将质粒和Lipofectamine2000稀释液混合在一起，室温放置15-45min后加入培养皿中，再加入750L无血清无双抗培养基混匀；（注：为一孔的试剂配制量）4-6h后换上完全培养基48h培养观察；注：24h看一次，如果培养基变颜色换培养基；,脂质体转染法的步骤：,转染后筛选,筛选所选用的抗生素跟转染所用的质粒上所带的真核筛选抗性基因有关的。标有neo（实际上应该是neoresistance）的载体，指载有降解新霉素的基因，新霉素作用于原核和真核细胞，对两者都有杀伤作用。用于转染后，稳定表达外源基因细胞的阳性筛选。,标有amp（实际上应该是ampresistance）的载体

6、，指载有降解氨苄青霉素的基因（内酰胺酶），作用于原核细胞，只对敏感菌有作用。用于克隆菌的筛选。最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo，所以筛选的时候用G418。G418是目前获得稳转最常用的试剂之一。,G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。,当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。目前G418的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛选以

7、及转基因动物等方面得以广泛应用。,由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，每孔100l加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100g/ml等12个级别，选择出在1014天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一般400-800g/ml左右。,筛选之前,由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太

8、晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每23天都要更换一次含有G418的筛选液。,加药时间,一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的遗传稳定的细胞克隆。,鉴定之后,转染的影响因素,细胞,（1）分裂细胞相比较非分裂细胞（2）贴壁细胞相比较悬浮细胞（3）传代次数（4）细胞数量（融合率）,2交叉污染,如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。,3载体DNA,对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的