第三章----蛋白质化学

1、第三章蛋白质化学,一、氨基酸二、肽三、蛋白质的分子结构四、蛋白质结构与功能的关系五、蛋白质的重要性质六、蛋白质的分类七、蛋白质的分离提纯及应用,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16，由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：样品中蛋白质的含量=样品含氮量6.25,三聚氰胺,相对分子质量：126，含氮量66.6，,蛋白质的生物学功能,一、氨基酸存在自然界中的氨基酸有300余种，但目前一般认为组成生物蛋白质的氨基酸仅有20种。蛋白质氨基

2、酸氨基酸非蛋白质氨基酸本课程所讲的氨基酸均为蛋白质氨基酸,（一）氨基酸的结构与分类1、氨基酸的结构共性(1)除脯氨酸（亚氨基酸）外，与羧基相邻的碳原子上含有一个氨基，因而称为氨基酸。,-羧基,-氨基,侧链,脯氨酸,(2)-氨基酸除甘氨酸外,其-碳原子是一个手性碳原子，天然蛋白质氨基酸均为L-型氨基酸。,甘氨酸,2、氨基酸的分类,按R基团的性质进行分类,*20种氨基酸的名称、缩写符号及分类如下:,非极性AA（1）按R基团的极性分酸性AA极性AA碱性AA极性非解离氨基酸疏水性R基团AA（2）按R基团的疏水性和亲水性分亲水性R基团AA,（3）按R基团的化学结构分脂肪族AA芳香族AA杂环族AA,非极性

3、氨基酸名称符号结构,丙氨酸Ala,alanine,lni:n,非极性氨基酸名称符号结构,丙氨酸Ala缬氨酸Val,valine,vli:n,异丙基,非极性氨基酸名称符号结构,丙氨酸Ala缬氨酸Val亮氨酸Leu,leucinelu:si:n,季碳原子周围连了4个碳叔碳原子周围连了3个碳仲碳原子周围连了2个碳伯碳原子周围连了1个碳,异丁基,非极性氨基酸名称符号结构,丙氨酸Ala缬氨酸Val亮氨酸Leu异亮氨酸Ile,叔碳,Isoleucine,aslu:si:n,仲丁基,非极性氨基酸名称符号结构,丙氨酸Ala缬氨酸Val亮氨酸Leu异亮氨酸Ile脯氨酸Pro,-吡咯烷基,proline,prli

4、:n,非极性氨基酸名称符号结构,丙氨酸Ala缬氨酸Val亮氨酸Leu异亮氨酸Ile脯氨酸Pro苯丙氨酸Phe,Phenylalanine,fenllnin,苯甲基,（苄基）,非极性氨基酸名称符号结构,丙氨酸Ala缬氨酸Val亮氨酸Leu异亮氨酸Ile脯氨酸Pro苯丙氨酸Phe色氨酸Try,吲哚（苯并吡咯）,Tryptophan,trptfn,非极性氨基酸（8）名称符号结构,丙氨酸Ala缬氨酸Val亮氨酸Leu异亮氨酸Ile脯氨酸Pro苯丙氨酸Phe色氨酸Try甲硫氨酸Met,甲基硫醚基,methionine,meani:n,极性大可解离带负电荷（酸性氨基酸）名称符号结构,天冬氨酸Asp,asp

5、articacid,sp:tk,极性大可解离带负电荷（酸性氨基酸）名称符号结构,天冬氨酸Asp谷氨酸Glu,glutamicacid,lu:tmik,极性大可解离带正电荷（碱性氨基酸）名称符号结构,赖氨酸Lys,lysine,lasi:n,极性大可解离带正电荷（碱性氨基酸）名称符号结构,赖氨酸Lys精氨酸Arg,胍基,arginine,:dni:n,极性大可解离带正电荷（碱性氨基酸）名称符号结构,赖氨酸Lys精氨酸Arg组氨酸His,咪唑,histidine,hstdi:n,极性非解离氨基酸名称符号结构,甘氨酸Gly,glycine,glasi:n,极性非解离氨基酸名称符号结构,甘氨酸Gly丝

6、氨酸Ser,serine,seri:n,极性非解离氨基酸名称符号结构,甘氨酸Gly丝氨酸Ser苏氨酸Thr,threonine,ri:ni:n,极性非解离氨基酸名称符号结构,甘氨酸Gly丝氨酸Ser苏氨酸Thr半胱氨酸Cys,cysteine,sstn,极性非解离氨基酸名称符号结构,甘氨酸Gly丝氨酸Ser苏氨酸Thr半胱氨酸Cys酪氨酸Tyr,对羟苯基,tyrosine,trsi:n,极性非解离氨基酸名称符号结构,甘氨酸Gly丝氨酸Ser苏氨酸Thr半胱氨酸Cys酪氨酸Tyr天冬酰胺Asn,甲酰胺,asparagine,sprdi:n,极性非解离氨基酸名称符号结构,甘氨酸Gly丝氨酸Ser苏

7、氨酸Thr半胱氨酸Cys酪氨酸Tyr天冬酰胺Asn谷氨酰胺Glu,glutamine,glu:tmi:n,分类中，极性大小，是否能解离，酸碱性氨基酸只涉及R基团。,人体所需的八种必需氨基酸赖氨酸(Lys)缬氨酸(Val)蛋氨酸(Met)色氨酸(Trp)苏氨酸(Thr)异亮氨酸(Ile)苯丙氨酸(Phe)亮氨酸(Leu),（二）氨基酸的理化性质1、两性解离及等电点两性解离氨基酸具有质子受体和质子供体的功能，是两性电解质。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,氨基酸的解离取决于所处溶液的PH值。,等电点(pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度

8、相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。一般一氨基一羧基的氨基酸等电点在pH6左右，这是由于羧基的解离程度大于氨基，故PI偏酸，碱性氨基酸pI在pH10左右，酸性氨基酸的pI在pH3左右。,氨基酸等电点的计算pI为兼性离子两边pK的平均值（pK为表观解离常数的负对数值）中性氨基酸：pI=(pK1+pK2)/2酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-)/2碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2P15,甘氨酸(Gly)滴定曲线,pI=(pK11+pK2)/2,+H+K1,+H+K2,氨基酸的解离常数可以用测定滴定曲线的实验方法求得。,甘氨酸的滴定曲线：,当

9、1mol的甘氨酸溶于水时，溶液的pH约为6，此时甘氨酸为兼性离子状态A0。若用标准NaOH滴定，已加入的NaOH摩尔数对pH作图，得滴定曲线B,在pH9.60处有一拐点（滴定中点)。,A0,A,B,A+A0A-,A0作为酸，由NH3+提供质子，逐渐变为A-,滴定中点时有一半A0变为A-,即A0=A-，,则K2=H+pK2=pH(拐点处）pK2就是A0的NH3+50%解离时溶液的pH值，K2就是此时溶液的H+,A-,A0,A0=A-,A+,A,B,A+A0A-,若用HCl滴定，得滴定曲线A，在pH2.34处有一拐点，拐点处pH即为pK1。R基不解离的氨基酸都有类似甘氨酸的滴定曲线。,A0=A+,

10、A0,A+,A,B,A+A0A-,A0=A-,甘氨酸的解离：,阳离子（A+）兼性离子（A0）阴离子（A-）,等电点时：A+=A-,因此H+2=K1K2pI=(pK1+pK2)/2所以，甘氨酸pI=(2.34+9.69)/2=6.02,所以,pI=(pK1+pKR)/2,谷氨酸(Glu)滴定曲线,（两个羧基pK值和的一半）,pI=(pKR+pK2)/2,组氨酸(His)滴定曲线,（两个氨基pK值和的一半）,氨基酸有时被用作缓冲剂，缓冲剂是当加入酸或碱时具有抗pH改变的溶液，缓冲剂起作用的pH范围称为缓冲范围，通常定义为pK+1至pK-1。生理pH条件下那些氨基酸具有缓冲作用？20种基本氨基酸中只

11、有组氨酸的咪唑基的pK最接近生理pH值（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。,2、氨基酸的光学性质构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(pI净电荷为负,pHpI净电荷为正,不处于等电状态的蛋白质分子，由于带有电荷，可采用电泳技术进行分离。,在等电点时，蛋白质没有相同电荷间的相互排斥，最不稳定，溶解度最小，极易形成沉淀析出；粘度、渗透压、膨胀性和导电能力均为最小。,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质的分子大小范围属于胶体质点的范围，是一种亲水胶体。,蛋白质具有胶体的一切特性，如布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、不能透过半透

12、膜及具有吸附能力等利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方法称透析法,蛋白质胶体的稳定因素（1）两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系。（2）蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子。,蛋白质相对分子量在60001000000之间。测定分子量的主要方法有：超离心法（沉降分析法）、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等和化学组成法。,（三）蛋白质分子量及其确定方法,沉降速度法,Fc,Fb,Ff,蛋白质在离心场中沉降时:Fc(离心力)=mp2（离心加速度）Fb(浮力)=Vp2=mp2Ff(摩擦力)=f=f(d/dt)通过测定沉降界面的移动

13、速度测定Mr.dx/dt为常数Fc-Fb=Ff(d/dt)mp（1-）2f,=,沉降系数：单位离心力场的沉降速度叫沉降系数，用s表示。s=(dx/dt)/2=mp(1-)/f沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分子形状相似时，s与分子量成正比。因此s常用作生物大分子的大小表示方法。由于s值较小，因此用110-13秒表示1个沉降系数单位（Svedbergunit）。S值与温度和溶剂有关，所以，一个分子的沉降系数定义为摄氏20度，水溶液条件下的s值为标准。1S=110-13（s）,凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。不论是天然凝胶还是人工合成的凝胶，它们的内部都具有很细微的多孔网状结构。凝胶层析的

14、机理是分子筛效应(又称分子筛层析)，如同过筛那样，它可以把物质按分子大小不同进行分离，但这种“过筛”与普通的过筛不一样。,凝胶过滤法,分子筛层析的工作原理,也叫凝胶过滤层析,在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。,A.小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。B.(1)蛋白质混合物上柱；(2)洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻在颗粒之外，大小分子开始分开；(3)小分子被滞留，大分子向下移

15、动，大小分子完全分开；(4)大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，可破坏蛋白质氢键和疏水作用使蛋白质变性。SDS带有很多负电荷，与蛋白质结合（1.4克SDS/1克蛋白质）后，SDS的负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。在SDS和巯基乙醇存在下，蛋白质和亚基的肽链完全伸展成长棒状（1.8nm），其分子量与肽链的长度成比例。,logM=a-bR,（四）蛋白质的沉淀反应,1、盐析法2、有机溶剂沉淀法3、重金属盐沉淀法4、生物碱

16、试剂沉淀法5、加热变性沉淀,沉淀方法,前两种方法可以使蛋白质不变性，后3种方法通常会使蛋白质变性。,盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析。,原因：高浓度的中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又抑制蛋白质的解离而减少蛋白质表面的电荷。,盐析,向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？,由于大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。,分段盐析：不同蛋白质析出时需要的盐浓度不同，调节盐浓度以使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分

17、段析出，这种方法称为分段盐析。,盐溶:通过提高中性盐浓度，在低离子强度溶液中使蛋白质溶解度增加。这是因蛋白质的荷电基团由于活度系数降低而趋于稳定所致。,2.有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用。,3.重金属盐沉淀与带负电荷蛋白质结成不溶性盐,4.生物碱试剂沉淀与带正电荷蛋白质生成不溶性盐,5.加热变性沉淀天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态。,硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响,离子强度,盐析,盐溶,（五）蛋白质的变性与复性蛋白质的变性天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但次级键被破坏，分子内部原有的有序紧密的空间结构变为无序而松散，致使其原有性

18、质发生部分或全部改变。变性后蛋白质的特性：生物活性减弱或丧失、理化性质改变、一些侧链基团暴露、生物化学性质改变。,变性蛋白质特点（蛋白质变性的结果）A.生物活性减弱或丧失B.侧链基团暴露:易与化学试剂反应C.理化性质改变:疏水基外露溶解度下降分子相互凝集,形成沉淀D.生化性质改变：结构伸展易被酶解,变性的因素,物理因素:加热、紫外线、X-射线、超声波等。,化学因素:酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸胍）、重金属盐等。,蛋白质变性的应用三氯乙酸抑制酶活性，消毒及灭菌，制作豆腐，卷发(烫发)防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件，。,蛋白质的变性,蛋白质复性去除变性因素后

19、，蛋白质仍可恢复其原有的构象和功能，称为复性。,（六）蛋白质的紫外吸收与呈色反应,1、蛋白质的紫外吸收,在280nm波长处有特征光吸收。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,2、蛋白质的呈色反应,氨基酸与水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝紫色反应。,茚三酮反应(NinhydrinReaction),蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上CONH肽键的化合物都呈此反应。,双缩脲反应(BiuretReaction),在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOCNHCONH2）能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫红色络合物,Cu2

20、+,(硷性溶液),由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合故可用双缩脲法测定蛋白质的含量。双缩脲反应是肽和蛋白质所具有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。,六、蛋白质的分类,按形状可分为,按分子组成分为,球状蛋白质纤维状蛋白质,简单蛋白质结合蛋白质,（一）简单蛋白质,简单蛋白质完全水解的产物为氨基酸，不含其它物质。,（二）结合蛋白质,结合蛋白质蛋白质非蛋白质组分（辅基）,糖蛋白（glycoprotein）脂蛋白（lipoprotein）色蛋白（chromoprotein）核蛋白(nucleoprotein)磷蛋白(phosphoprotein)金属蛋白（metalloprotein）,七、蛋白质的分离提纯（一）选材及预处理1.选材主要原则是原料易得，蛋白含量高。蛋白质的主要来源包括动物、植物和微生物。微生物因为容易培养而常用。2.细胞破碎如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白