MTT原理方法及操作步骤

1、MTT原理、步骤、结果分析方法和注意事项MTT原理MTT全部为3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5- di-phennytetrazoliumromide，中文化学名称3-(4是黄色染料。MTT比色法是检测细胞生存和生长的方法。其检测原理是，活细胞线粒体中的丁二酸脱氢酶可以将外源MTT还原为水不溶性的青紫结晶甲(Formazan)，使细胞沉积，而死细胞则不然。二甲基亚砜(DMSO)可以溶解细胞内的金属，用酶联免疫吸附分析仪间接反映活细胞数，以测定490nm波长下的光吸收值。在特定细胞数范围内MTT结晶形成的数量与细胞数成正比。该方法广泛用于部分生物活性因子

2、的活性检测、大规模抗癌药物筛选、细胞毒性测试、肿瘤辐射敏感性测定等。以高灵敏度、经济性为特点。缺点：由于MTT还原生成的a产品不溶于水，所以溶解后才能检测到。这不仅会增加工作量，还会影响实验结果的准确性，溶解甲的有机溶剂也会对实验者造成危害。MTT溶液配制方法通常，该方法的MTT浓度为5mg/ml。因此，取0.5克MTT，在100毫升磷酸缓冲液(PBS)或没有酚红的培养基中使用0.22m滤膜去除溶液中的细菌，保存4 的红光即可。在制造和保存过程中，容器最好用铝箔包装。做实验的时候，我通常认为最好关掉超顺台的荧光灯来避光。要注意，MTT方法只能用于检测细胞数量和相对活性，但不能测量细胞绝对数量。

3、用Zymogram测试结果时，为了确保实验结果的线性性，MTT吸光度最好在0-0.7范围内。MTT通常最好是在活动状态下发货。4C被光在2周内保管或制成5mg/ml，长期保存在-20度，为了避免重复的冻融，避免小容量化妆，用光包或黑纸或箔纸包在被光上，进行分解。我一般在EP管上装入MTT粉，使用时配合，直接加到培养板上，不必一次配合那么多。特别是MTT变成灰绿色后，绝对不能再使用了。MTT有致癌性，使用时要小心，有条件地戴上那个透明的副膜手套比较好。配制的MTT需要无菌，MTT对细菌很敏感。即使去96鸭子版，也最好不要发光。时间短或不能放心的时候，关掉操作台灯也可以。MTT溶解为PBS(ph=

4、7.4)。PBS公式：NaCl 8g KCl 0.2g na 2 hpo 4 1.44g kh2po 4 0.24g pH 7.4，固定容量1L。一般MTT方法实验阶段：1:接种细胞：以10%胎儿小牛血清培养液为单细胞悬浮液，每孔1000-10000个细胞接种96孔，每孔200ul。23360培养细胞：和一般培养条件一样，培养3-5天(培养时间可以根据试验目的和要求决定)。3:着色：培养3-5天后，每个孔使用MTT溶液(5mg/ml用PBS制造，pH=7.4)20ul。继续孵化4 h，结束培养，小心吸入孔内的上清液，悬浮细胞需要离心后吸出孔内的上清液。在每个孔中加入150ul DMSO，振动1

5、0分钟，使晶体充分熔化。4:比色：选择490nm波长，测量酶联免疫吸附分析仪的共光吸收值，并记录结果，以时间为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。药物MTT法实验阶段附着细胞：1:收集对数期细胞，调整细胞悬浮液的浓度，在每个孔中添加100ul，使要测量的细胞密度达到1000- 10000孔(边缘孔填充无菌PBS)。在233035% CO2，37 孵化，直到细胞层复盖孔底(96孔平底)，添加浓度梯度的药物原则上是细胞贴在墙上，可以使用约2小时，或半天，但我们经常在前一天下午铺板，第二天早晨放药。通常，5-7个拔模为每个孔100ul制造3-5个开口。建议设置5个。否则很难反映实际情况3: 5

6、%CO2，37 孵化16-48小时，倒置显微镜下观察。每4:孔添加20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。如果药物和MTT能反应，离心后放弃培养液，在添加包含MTT的培养液之前用PBS冲洗2-3次之前注意。结束5:培养，小心地吸出孔培养液。在6:每个孔中加入150ul二甲基亚砜，摇晃，低速振动10分钟，使晶体充分熔化。每个孔的吸光值是从enzyme-linked immunosorbent detector od 490nm测量的。7:还设置零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，并设置对照组孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。悬浮细胞：1:

7、收集对数期细胞，调节细胞悬浮浓度1106/ml，补充式1640(无血清)培养基40ul放线菌素D(毒性)10ul用培养液稀释(储液100mg/ml，需要事先测试才能找到最佳稀释度，1333610-1:12)；需要检查10ul；细胞悬浮50ul(即5104cell/孔)，总计100ul添加到96孔板(边缘孔填充无菌水)。每个板的控制组(添加100ml 1640)23360在37，5%CO2孵化16-48小时，倒置显微镜下观察。每个3:孔添加10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4 h。(悬浮细胞推荐WST-1，培养4 h后可以跳过步骤4)，直接酶联免疫吸附分析器OD

8、570nm(630nm校准)测量每个孔的吸光度值)4、离心(1000转x10min)，小心地吮吸，在每个孔中放入100 ul二甲基亚砜，在摇床中低速振动10分钟，使晶体完全溶解。每个孔的吸光值在酶联免疫吸附分析仪OD570nm(630nm校准)中测量。5、同时调整零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)、比较孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)、每组3个复合孔。注意事项：(1)选择适当的细胞接种浓度。(2)防止血清干扰：一般选择低于燃烧血清10%的培养液进行实验。着色后，尽可能吸出孔内残留的培养液。(3)设置空白对照组：空白对照组，与只添加培养液(无细胞)的实验并行。其他测

9、试阶段是一致的，最终的非颜色用空色调调整0。(4) MTT实验吸光度最终在0-0.7之间，超出此范围则不是直线关系。(5)要利用96孔板培养细胞测定MTT细胞活性，必须在将DMSO添加到本书所述的200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO之前去除培养液，使DMSO能够溶解a Zan粒子，进行非比寻常的测定(6)一般每个孔有4000个细胞为宜，共2000个/ml，MTT 20ul的浓度，4小时后冲洗上等液，注意不要冲洗甲流病，然后在每个孔中放入150ul DMSO，在脱色的摇床中振动10分钟后测定吸收值。旋转MTT法原理、步骤和注意事项MTT原理MTT全部为3-(4，5)-dimet

10、hylthiahiazo (-z-y1)-3，5- di-phennytetrazoliumromide，中文化学名称3-(4是黄色染料。MTT比色法是检测细胞生存和生长的方法。其检测原理是，活细胞线粒体中的丁二酸脱氢酶可以将外源MTT还原为水不溶性的青紫结晶甲(Formazan)，使细胞沉积，而死细胞则不然。二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞内的金属，在490nm波长(目前用作570nm的570nm波长)使用酶联免疫吸附分析仪间接反映活性细胞数。在特定细胞数范围内MTT结晶形成的数量与细胞数成正比。该方法广泛用于部分生物活性因子的活性检测、大规模抗癌药物筛选、细胞毒性测试、肿瘤辐射敏感性测定等。

11、以高灵敏度、经济性为特点。缺点：由于MTT还原生成的a产品不溶于水，所以溶解后才能检测到。这不仅会增加工作量，还会影响实验结果的准确性，溶解甲的有机溶剂也会对实验者造成危害。MTT溶液配制方法通常，该方法的MTT浓度为5mg/ml。因此，取0.5克MTT，在100毫升磷酸缓冲液(PBS)或没有酚红的培养基中使用0.22m滤膜去除溶液中的细菌，保存4 的红光即可。在制造和保存过程中，容器最好用铝箔包装。做实验的时候，我通常认为最好关掉超顺台的荧光灯来避光。要注意，MTT方法只能用于检测细胞数量和相对活性，但不能测量细胞绝对数量。用Zymogram测试结果时，为了确保实验结果的线性性，MTT吸光度

12、最好在0-0.7范围内。MTT一般最好过滤4的光照射保存2周，有效使用，或制作为5mg/ml，长期保存-20度，避免重复冻融，使用低容量化妆，用菲光袋或黑纸和箔进行感光包装，防止分解。我一般在EP管上装入MTT粉，使用时配合，直接加到培养板上，不必一次配合那么多。特别是MTT变成灰绿色后，绝对不能再使用了。我自己的工作一般是15毫升准备，过滤后4菲光保存，2周内就会耗尽。MTT有致癌性，使用时要小心，有条件地戴上那个透明的副膜手套比较好。配制的MTT需要无菌，MTT对细菌很敏感。即使去96鸭子版，也最好不要发光。时间短或不能放心的时候，关掉操作台灯也可以。MTT溶解为PBS(ph=7.4)。P

13、BS公式：NaCl 8g KCl 0.2g na 2 hpo 4 1.44g kh2po 4 0.24g pH 7.4，固定容量1L。一般MTT方法实验阶段：1:接种细胞：将含10%胎儿犊牛的血清培养液和1个细胞悬浮液结合，每个孔1000-10000个微量细胞被接种在每个孔200ul的孔板上。23360培养细胞：和一般培养条件一样，培养3-5天(培养时间可以根据试验目的和要求决定)。3:着色：培养3-5天后，每个孔使用MTT溶液(5mg/ml用PBS制造，pH=7.4)20ul。继续培养4个小时。终止培养，小心地吸出孔内的上等液，悬浮细胞的情况是离心后，要吸出肺孔内的上等液。在每个孔中加入15

14、0ul DMSO，使摇晃振动脱色，使晶体充分熔化10分钟。4:比色：选择490nm(570nm)波长，在酶联免疫吸附分析程序中测量每个共光吸收值，并记录结果(以小时为单位)横坐标、吸光度值是纵坐标绘图细胞生长曲线。药物MTT法实验阶段附着细胞： (我的主要工作是附着细胞)1:收集对数期细胞，调整细胞悬浮液的浓度，每个孔加100ul，铺上将被测量细胞密度调整为1000的板子-10000孔(角孔填充无菌PBS)。在233035% CO2，37 孵化，细胞附着，浓度梯度添加药物，原则上细胞附着在墙上，可以使用约2小时，或半天，但我们经常在前一天下午铺板，第二天早晨放药。通常制作5-7个渐变，每个孔1

15、00ul，3-5个复杂的孔。最好设置5个。否则很难对实际情况做出反应。3: 5%CO2，37 孵化24-72小时，倒置显微镜下观察。每4:孔添加20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。如果药物和MTT能反应，离心后，可以废弃培养液，用PBS冲洗2-3次，加入含有MTT的培养液。结束5:培养，小心地吸出孔培养液。在6:每个孔中加入150ul二甲基亚砜，摇晃，低速振动10分钟，使晶体充分熔化。酶联免疫吸附法在传染病检测器OD490nm(570nm)中测量每个孔的吸光值。7:还设置空组(培养基、MTT、二甲基亚砜)、对照组孔(细胞、相同浓度的药物溶出介质)质量，培养液，M

16、TT，二甲基亚砜)。悬浮细胞：1:收集对数期细胞，调节细胞悬浮浓度1106/ml，补充式1640(无血清)培养基40ul放线菌素D(毒性)10ul用培养液稀释(储液100mg/ml，需要事先测试才能找到最佳稀释度，1333610-1:12)；需要检查10ul；细胞悬浮50ul(即5104cell/孔)，总计100ul添加到96孔板(边缘孔填充无菌水)。每个主机板组控制(附加100ml 1640)。23360在37，5%CO2孵化16-48小时，倒置显微镜下观察。每个3:孔添加10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4 h。(悬浮细胞推荐WST-1，培养4 h后可以跳

17、过步骤4)，直接酶联免疫吸附分析器OD570nm(630nm校准)测量每个孔的吸光度值)4、离心(1000转x10min)，小心地吮吸，将100 ul二甲基亚砜放入每个孔，在摇床中低速振动10分钟，使晶体完全溶解。每个孔的吸光值在酶联免疫吸附分析仪OD570nm(630nm校准)中测量。5、同时调整零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)、比较孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)、每组3个复合孔。注意事项：(1)选择适当的细胞接种浓度。每个孔有1000-10000个，但是还要查看细胞种类和状态。我的工作是通过大约2000到8000个孔抑制肿瘤细胞的生长和增殖。如果2000过低，8000过高，则阴性组中高于5000的吸收率大于1.5。所以我的A549实验通常使用3000-5000。通常每个孔4000个细胞是合适的(2)防止血清干扰：一般选择低于燃烧血清10%的培养液进行实验。着色后，尽可能吸出孔内残留的培养液。(3)设置空白对照组：空白对照组，与只添加培养液(无细胞)的实验并行。其他测试阶段是一致的，最终的非颜色用空色调调整0。(4) MTT实验吸光度最终在0-0.7之间，超出此范