紫杉醇的分离工艺

1、紫杉醇的分离工艺红豆杉针叶、树皮、根的采集原料的干燥及研磨初级萃取次级萃取水相（含键合相）有机相色谱纯化纯品紫杉醇图11-4紫杉醇分离纯化工艺紫杉醇的分离纯化工作开展较早，最早的分离巩义市1966年采用400根试管的逆流分配色谱法，从12g太平洋红豆杉树皮中提取了少量紫杉醇，历时两年，这种工艺十分琐碎，收率极低。随着相关科学技术的不断发展，分离工艺也获得了很大的改进。一般来说，紫杉醇的分离工艺可以分为粗提和纯化两个阶段，分离纯化过程可用图11-4表示。紫杉醇粗提工艺粗提阶段的目的在于从原料液中尽可能多的提取目标产物，所得到的物料在进行后续的提纯直至获得纯品。粗提过程中初级萃取和次级萃取所采用的

2、溶剂不同可以导致除去杂质不同，不同时期研究者对这两个过程的研究结果列于表11-5中。目前用于提取紫杉醇的最普遍的初级萃取剂是乙醇（甲醇）和水，采用95:5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间3560min；采用纯甲醇，所需萃取时间则为1648h。在大多数情况下还需对甲醇初级萃取物进行次级萃取。一般是在初级萃取物中加入二氯甲烷和水的混合物，即液-液萃取，该方法可以有效地除去萃取液中50（质量比）的非紫杉醇烷类物质。如果采用一个较为复杂的分离体系，发现所有的紫杉醇都在氯仿相中。次级萃取除了可采用各种有机溶剂进行液-液萃取外，还可以采用固相浸取法和超临界流体萃取法。这两种方法的共同特点是有机溶剂用量少

3、，减少了环境的污染。若用枝叶为原料，由于枝叶特别是枝叶中含有许多色素和蜡质，无疑将大大增加紫杉醇的提取分离难度。这要求首先在甲醇粗提取物中加入低极性溶剂如正已烷以除去此物质，该法可除去红豆杉枝叶中多达72%的可溶于正已烷的杂质。五、正相色谱过程为核心的紫杉醇分离纯化工艺正相色谱是紫杉醇分离纯化工艺中普遍采用的方法，在早期紫杉醇分离纯化的研究中占有主导地位，至今仍在广泛应用。在紫杉醇分离纯化过程中，正相色谱的突出优点是固定相价格廉价，用普通的硅胶即可，而且洗脱用流动相多为挥发性很强的有机溶剂，溶剂回收简单、能耗低。鉴于正相色谱的这些优点，综合一些已有的工艺过程，针对我国的红豆杉资源给出了一个分离

4、纯化紫杉醇的工艺。该生产工艺突破已有专利的保护，具有明显的特色。已有产工艺图博弈有专利的保护，分离纯化紫杉醇.试验物系用甲醇、乙醇或二氯甲烷-甲醇（1：1）对云南红豆杉树皮浸提得到起始物浸提膏粉，溶剂回收，所得到浸膏用二氯甲烷-水或氯仿-水进行分配萃取，最后处理有机相，得到含紫杉醇大约1%的浸膏粉，将试验用的浸膏粉用HPLC检测，分析谱图发现有紫杉醇物质峰，溶解浸膏粉的溶剂为甲醇（色谱纯）。因有一些杂质在227nm波长处没有被吸收，造成谱图中紫杉醇的面积百分比分数高于实际情况，外标法测定浸膏粉中紫杉醇的含量为1.02%。作为工业放大的需要，实验中涉及的有机溶剂均匀为市售的工业级，使用时蒸馏除去

5、不挥发残留。试验用硅胶300-400目，拌样用硅藻土采用Ceite公司产品，150目；色谱柱是订做的玻璃柱，柱参数在涉及时作具体说明。分析检测用TLC法结合HPLC法，TLC法采用E.MERCK公司生产的铝制60F254硅胶板，班上硅胶厚度0.2mm，HPLC流动相为甲醇-水（65:35）或乙腈-水（47:53），流速1.0mL/min，双波长检测，检测波长227nm、233nm。样品预处理浸膏样品中含有大量杂质，它们在液相色谱固定向上的竞争性吸附或不可逆吸附会导致固定相用量增加，目标产物的分离度降低，分离效率低下等。因此，在分离纯化的早期阶段就使用色谱过程是不经济的。对样品选择合适的方法进行

6、预处理，提高目标产物的浓度，在提高效率和操作控制方面都会带来方便。 固-液浸取 浸膏用品来源于树皮、枝叶或植株体的其他部位，除含量很低的目标产物紫杉醇外，还含有各种类型的极性和非极性杂质。在获得浸膏的粗提过程中，以去除大部分杂质，但仍有相当部分滞留在浸膏中。这部分杂志中，一些低极性或非极性类杂质如焦油等，会粘附在作为色谱固定向的硅胶上，是硅胶失去吸附力，而且随流动相运动被洗脱下来，会给洗脱馏分的干燥带来困难。对于这类杂质，可用一些低极性的醚类和烷类有机溶剂进行固-液萃取出去。从石油醚（60%90%）对浸膏进行固-液萃取的结果可以看出，随石油醚用量的增加，萃取的杂质百分率也在增加，但当石油醚的用

7、量达到原始浸膏的5倍（mL/g），被浸出的萃取的杂质百分数则不再有明显变化。因此，和原始浸膏的质量相比，5倍体积的石油醚可以认为是一个优化的值。对浸膏进行匀浆搅拌与否，杂质浸出的百分率差别很大，搅拌的效果显著。但是，搅拌后沉淀颗粒过细，过滤有困难，需预先在过滤设备上预涂一层硅藻土或其他类型的助滤剂帮助过滤。固-液浸取中的有机溶剂也可用正已烷或环已烷代替，具有相似的效果。综合以上研究，可得固-液浸取出去非极性杂质的优化条件是：匀浆搅拌，按体积质量比5倍体积的石油醚可除去10%12%的杂质。固-液浸取过程目标产物紫杉醇的收率接近100%。碱洗 将经石油醚固液浸取后的浸膏样品用一定浓度的NaOH溶液

8、洗涤，是本工艺的独到创新之处。由于植株体中含有大量鞣质酸等其他一些酸类杂质，和碱溶液发生一种类似皂化的反应，生成一些易溶于的物质，可以用水洗涤除去。用碱性溶液洗涤去除杂质在制作药物中间体环孢素时使用的非常普遍，但在紫杉醇分离纯化过程中的应用至今还没有报道，原因在于紫杉醇在碱性环境中极其不稳定，很开裂解成巴卡亭III和其他一些物质。用乙酸乙酯作溶剂，在用1molL的NaOH溶液裂解紫杉醇制备少量巴卡亭III的过程中发现，紫杉醇没有发生变化（数据未列出），表明用乙酸乙酯作溶剂的水解反应能够屏蔽紫杉醇的裂解反应。这一结论使浸膏样品的碱洗过程有了理论基础。不同浓度NaOH溶液对经石油醚固液浸取后浸膏样

9、品进行碱洗的结果，表明浸膏用10倍体积（mL/g）的乙酸乙酯溶解，加入等体积的碱溶液，结果显示，NaOH浓度增加时，被去除杂质的百分率也增加，但当NaOH溶液浓度增加到1mol/L以上后，再增加则无明显影响。而且，由于酯的水解，溶液过高是有机溶剂消耗量变大，因此，1mol/L较为合适。同样，碱溶液用量也有类似影响，根据实验结果，以等体积较好。将碱洗前后浸膏样品的图谱相比较几乎没有变化，可知碱洗主要除去一些在227nm或233nm处没有吸收峰的杂质，而紫杉醇则不受影响。碱洗过程具体步骤为：用10倍体积（mL/g）乙酸乙酯溶解适量浸膏；加入等体积1mol/L的NaOH溶液，搅拌1020min；分相

10、后有机相用0.5倍NaOH溶液体积的蒸馏水洗涤两次。其中第二次洗涤常伴有乳化的现象，需加入适量盐帮助分相或直接用盐水洗涤，过程中乙酸乙酯因水解大约损失一半；洗涤后有机相用无水硫酸钠进行脱水，根据后面工序的需要减压浓缩至25%35%有机相体积。这一步骤可取出最高达60%的杂质（以石油醚固液浸取后的干浸膏量为基准），因乙酸乙酯少量溶于水是紫杉醇有所损失，收率在97%左右。 己烷沉淀 将碱洗后得到的浸膏样品溶解在一种极性较强的溶剂中，向其中缓缓滴入己烷（正己烷或环己烷）溶剂，可以使一些石油醚不能萃取除去的低极性杂质留在母液中，而将紫杉醇等目标产物沉淀下来。溶解浸膏样品的溶剂可以是丙酮、二氯甲烷或乙酸

11、乙酯，为方便工艺的前后衔接，以乙酸乙酯为好。不同体积比例的正己烷加入碱洗后浸膏样品的乙酸乙酯溶液中的沉淀结果显示，当加入己烷的量较小时，沉淀的量很少，大部分留在母液中，紫杉醇损失较大；在加入己烷体积和溶液体积比在6以上时，沉淀量几乎不再变化，但HPLC测定发现，体积比在10以下时，紫杉醇不能沉淀完全，仍有少量留在母液当中。因此，己烷沉淀以加入10倍浸膏样品的乙酸乙酯溶液为好，加入量再大，不但对除去杂质没有多少帮助，还会造成己烷使用量过大，为溶剂回收造成不必要麻烦。这一步骤也和前一工序的有机相浓缩有关。浓缩的比例太小会影响去除杂质的量，太大又会造成溶剂用量过大的相同问题。实验证实，有机相以浓缩到

12、碱洗后乙酸乙酯相体积的25%-30%为佳。（4）一次层析 浸膏样品经己烷沉淀后，目标产物紫杉醇的含量已经接近5%，除一些难以除去的色素外，杂质含量主要是一些紫杉烷类化合物，其中不乏价值很高的 紫杉醇类似物如三尖杉宁碱、10-去乙酰基紫杉醇、巴卡亭等，同样需要分离纯化。因为目标产物的含量还很低，尤其伴随有结构性质相似的类似物三尖杉宁碱一次层析将紫杉醇纯化到一定的纯度难度很大，而且也不经济。比较合理的方法是，先用一个层析过程粗分一下，使富集的馏分中目标产物有较高的含量，为进一步分离纯化奠定基础。因为这步层析仅是粗分，对色谱柱高径比的要求不是很大，硅胶用量也不必太高，而且可以使用较高的洗脱速度。从常

13、州市第二干燥设备厂订做的GXCX50型，能实现柱切换技术的中压高效液相层析设备，通过阀门的开启和关闭进行柱切换；层析段有效床层容量6L，内径100mm，柱高径比7:1；承载样品的预柱容量3L，高径比3：1，设计工作压力为2.5MPa。洗脱体系：洗脱过程中可以通过采用极性较强的溶剂和极性较低的溶剂混合调整极性来改变洗脱强度。因为浸膏样品中紫杉烷类物质种类多，极性差别很大，以梯度洗脱较为合适。但连续梯度洗脱较为繁琐，考虑到实际操作的方便，采用分段梯度（Step-wise Gradient）操作最为适宜。洗脱中作为流动相的溶剂可以选择己烷-丙酮、二氯甲烷-丙酮、己烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-乙酸乙酯或氯

14、仿-甲醇体系等，但从溶剂回收难易、洗脱强度大小、固定相循环使用和溶剂毒性等方面综合考虑，流动相以己烷-丙酮为优化选择。样品制备 经己烷沉淀后的 浸膏样品在己烷-丙酮作为流动相的洗脱剂中溶解度不是很大，以固态上样法较为合适。将样品按1:10（g/ml）的 比例溶解在丙酮中，然后加入5倍两量（以浸膏样品质量为基准）的硅藻土，拌匀后自然风干，如果量较大，可以将该混合物在40下用旋转蒸发仪蒸干，得到固态样品。用时加到色谱柱上部。洗脱之前，可在样品上端覆盖一层粗砂或玻璃珠，以防止样品界面被破坏。洗脱模式：洗脱模式即分段梯度洗脱过程中的梯度构成，参量标准是固定相床层的有效体积，可先用干柱色谱法进行初步估计

15、。干柱色谱法师将干的吸附剂装入色谱柱中。将待分离的样品配成浓溶液或吸附于少量填料上，然后上样。当洗脱液依靠毛细作用从柱上端流下接近色谱柱底部时，停止洗脱，将吸附剂分段从色带位置挖出或切开，用适当的溶剂洗出。这种方法溶剂消耗量少，所需时间短，可根据目标产物在柱中的位置确定洗脱模式。色谱柱是一根容量为10ml的小针管，内径10mm，高接近7cm，上样量0.1g，溶于1ml丙酮，拌入0.5g硅藻土，风干，柱内硅胶分段洗脱后用TCL分析确定色斑位置。这样可大致判断一下洗脱梯度的模式：在己烷-丙酮为8:2时，紫杉醇的谱点几乎不移动；到7:3时，紫杉醇能够被洗脱，但谱点移动速度很慢；如果己烷-丙酮体积比加

16、大到6:4，紫杉醇斑点接近柱口端，表示6:4的己烷-丙酮对紫杉醇有足够的洗脱强度。至此，洗脱结构可初步设定为，以8:2或7:3的己烷-丙酮起始，洗脱一些吸附能力较差的色素和一些极性较低的紫杉烷类物质，以6：4完全洗脱紫杉醇后结束。为使谱带更好地分离，可以根据是研究过在中间加入适合的梯度。考虑到有一些极性很强的紫杉烷类物质如10-DAB等，可在6：4的梯度结束后再接一个洗脱强度更大的梯度以回收副产物，最后用纯丙酮顶洗硅胶循环使用。在洗脱模式初步确定，需用小规模的试验进一步确定。一次层析中洗脱模式的优化选择为：2BV（Bed Volumn）70：30+3BV 65:35+3BV 60:40正已烷-

17、丙酮。最后，根据浸膏样品中回收副产物要求，可适当再增加洗脱梯度。 固定相用量：一次层析过程中固定相的适合用量可以用硅胶和处理的浸膏质量比作为参数进行表征。硅胶用量大小，分离效率低，各馏分之间交叉较多，难以进行下一步分离：而硅胶用量太大，在到达粗分的前提下又会造成浪费。按照下一步洁净的标准，这不层析中要求目标产物紫杉醇的纯度要在30%以上，而且要求紫杉醇所在的馏分和前后馏分的交叉要尽可能小，否则影响一次操作的效率。研究发现，一次层析过程中，硅胶用量与浸膏质量比为10:1时是个较好的选择。 柱切换技术：如果直接将样品加在色谱柱柱顶，除了洗脱时会增加柱压外，再一次操作结束进入下一个循环时，需要挖出上

18、一次承载样品的硅藻土，非常烦琐，尤其在大规模生产时，频繁拆装色谱柱会影响生产进程。柱切换技术可以解决这一问题，将色谱柱设计成两段，一段较短粗，负载浸膏样品的硅藻土，另一段高径比较大，是层析过程的有效的段。洗脱过程中在线或间隔检测洗脱液，发现负载样品的柱段中没有目标产物时，可用一个转换阀直接将流动相导入层析过程的有效段，同时拆装样品柱，负载下一次样。由于承载样品用的硅藻土是一种是活的吸附剂，少量流动相便可以将目标产物洗脱完全。试样中发现，当硅藻土用量和浸膏比为5:1时，按前面优化的洗脱结构，用3BV硅藻土床层体积的流动相便可以将目标产物完全洗脱。层析因硅胶的不可逆吸附是目标产物有所损失，效率约为

19、95%。 一次结晶 粗分后目标产物能否进行结晶是衡量粗分结果的标准。结晶体系可以是甲醇-水或乙醇-水，但乙醇对紫杉醇溶解能力较差，处理量小，以甲醇-水体系脚架。将一次层析中含目标产物紫杉醇的馏分蒸干后，按8mL/g的比例溶解在甲醇中，同时在搅拌的情况下缓缓滴入1/3甲醇体积的双蒸水，冷却48h以上可得呈白色发黄的针状晶体，这一步紫杉醇的纯度可达50%70%，收率95%以上。将结晶后母液用适量乙酸乙醇萃取，脱水蒸干，和下一批物料类及循环处理，可提高总收率。 溴加成 三尖杉宁碱是紫杉烷类物质中结果和性质与紫杉醇最为相似的物质，非常难以分离，但它们仍有一些可供利用的不同之处。比较一些三尖杉宁碱和紫杉

20、醇的侧链结构，在三尖杉宁碱的侧链结构中，由于C5-C4酰胺的影响，C7-C6的双键电子云C6乃至C5方向便宜而有利于溴的进攻；而紫杉醇侧链的这一位置系一苯环，相对于C其电子云密度比较均匀而稳定。在温和条件下，三尖杉宁碱易发生溴加成，而紫杉醇则无此反应。利用三尖杉宁碱和紫杉醇结构中的这一差异，采用溴加成的方法改变三尖杉宁碱的侧链就够，从而改变其分子的极性，可大大降低三尖杉宁碱和紫杉醇锋利的难度。三尖杉宁碱的溴加成反应为：三尖杉宁碱2“,3”二溴三尖杉宁碱2Br2，CHCl3Zn，乙酸反应是可逆的，在乙酸的条件下，用锌粉就可以将三尖杉宁碱还原回来。这一点事溴氧化工艺不可比拟的。反应以在氯仿中进行为

21、好，但氯仿的储存过程一般要加入乙醇做稳定剂，否则易分解产生光气。乙醇的存在使反应不能进行，所以对氯仿要进行处理。用浓硫酸洗涤氯仿，让后用水洗涤两次，无水硫酸钠对氯仿相脱水后最后进行蒸馏，可得不含稳定剂的氯仿。溴加成具体的操作为:按1:30（g/ml）的比例将一次层析得到的粗品加入氯仿中溶解，搅拌情况下快速滴入少量溴素，室温下反应5min停止；用10%的Na2S2O3溶液淋洗去除未反应掉的溴素;用水或盐水淋洗两次，无水硫酸钠脱水后蒸干，样品进入下步工序。通过对经溴加成前后样品图谱的比较，可以体会到溴加成的效果。溴加成的收率为95%。溴加成工序可以放在一次结晶之前，单一杂质多，反应时间会长些。 二

22、次层析 三尖杉宁碱经溴加成后的产物2“,3”二溴三尖杉宁碱极性发生了变化，需在经一次硅胶色谱柱实现和紫杉醇的分离。已烷-乙酸乙酯可以选做洗脱体系。这时候样品中的杂质除一些色素和2“,3”二溴三尖杉宁碱外，还常常含有一种紫杉醇的手性异构体7-表紫杉醇，它7位的基团和紫杉醇呈手性异构，性质非常相似。对于7-表紫杉醇的分离，目前尚没有针对性的报道，可选用高径比较大的色谱柱和适当增加硅胶用量。研究发现，当色谱柱的高径比在8:1以上，干法装柱，固定相硅胶用量和样品的质量比为30:1时，紫杉醇和7-表紫杉醇能够实现好的分离。洗脱模式用干柱色谱结合小规模试验证实以已烷-乙酸乙酯60:40（3BV）55:45 （2BV）50:50（5BV）为佳。从最初的石油醚固-液萃取到溴加成后，样品量已经很小，所以二次层析过程中的固定相用量和溶剂消耗在经济上都是可以接受的。二次层析后紫杉醇的纯度在90%以上，收率接近95%。层析过程中紫杉醇所在馏分和前后各有一段较叉可在分批操作后，将较差馏分和结晶母液的乙酸乙酯萃