家畜育种学14动物育种学新技术

1、,第十四章 家畜育种新技术 （生物技术在动物育种中的应用）,第一节 生物技术概述 第二节 细胞工程技术的应用 第三节 基因工程技术的应用,一、生物技术的概念 生物技术（Biotechnology）其英语的本意是“生物工艺学”，一些论著又将其译为“生物工程”，其定义至今没有一个十分经典的表述，常见的表述有两种： 从微观上认识和控制生物遗传与繁殖过程的技术。 在探索生物所具有的多种多样功能的同时，用工程设计的方式把这些功能应用于各个领域、或人工摸拟再现生物功能，为人类提供产品或服务的新兴技术。,第一节 生物技术概述,生物技术是以生命科学研究成就为基础的综合性技术，是从微观上认识和控制生物的遗传物质

2、和遗传过程，了解生命的全貌，其目的是要解决人类社会中的人口、粮食、肉蛋奶、环境能源医疗等各种具体问题。,二、生物技术应用的目的,三、生物技术的主要组成部分,基因工程技术 细胞工程技术 酶工程技术 发酵工程技术,四、在家畜育种中应用的生物技术,细胞工程技术 细胞遗传学技术 动物繁殖学技术 基因工程技术 分子遗传学技术（主要涉及基因组分析技术、DNA诊断技术、转基因技术等） 分子数量遗传学技术,动物繁殖学技术 人工授精 配子低温冷冻保存 X、Y精子分离 同期发情、超数排卵与分娩控制 卵母细胞的体外培养与体外授精 胚胎冷冻保存与胚胎移植 核移植与细胞克隆 嵌合体的制备,分子数量遗传（molecula

3、r quantitative genetics）学。将分子生物技术和方法与数量遗传学相结合，研究数量性状基因座（Quantitative Traits Loci，QTL）定位与分子标记辅助选择（Molecular Assistant Selection，MAS）的理论和方法。这一学科领域的发展，将给家畜育种带来一次新的飞跃。,分子遗传学技术,第二节 细胞工程技术的应用,人工授精技术 配子低温冷冻保存技术 同期发情、超数排卵技术 体外受精技术 性别控制与胚胎性别鉴定技术 克隆技术,一、人工授精技术给家畜育种带来的效应,通过人工授精，提高了优良种公畜的利用率，迅速扩大优良遗传特性和高产基因在群体中

4、的影响。 依靠人工授精，提高了种公畜的利用率，大大减少了种公畜的需要量，在相同的选择基础上，提高了种公畜的选择强度，加快了群体的遗传进展。从生产上讲，节约了成本。,建立了AI育种体系（Aggregative Index Breeding System） 在畜群中广泛应用人工授精技术，精液全部来自经遗传评定验证的种公畜； 在育种群中实施大规模的、规范化的生产性能测定； 通过“定向选配”，有计划地培育后备公畜； 组织科学、严格的公畜后裔测定，并应用先进的数据统计分析方法估计育种值，提高选种的精确性。,一、人工授精技术给家畜育种带来的效应,AI育种体系在奶牛育种中取得的效果：在过去40余年中，美国、

5、加拿大等奶牛生产发达国家，因坚持AI育种体系，全国奶牛群体数量减少了1/3，而总产奶量却稳中有升，说明奶牛的平均产奶量提高了30%以上。据1996年统计分析结果，我国北京市自1972年建立种公牛站开始全面推广冷冻精液人工授精以来，奶牛产奶量平均每年获得近50kg的遗传进展，在25年中奶牛平均单产净增2200kg。,一、人工授精技术给家畜育种带来的效应,AI育种体系在猪育种中取得的效果：在上个世纪80年代末90年代初，AI育种体系开始在猪育种中应用，至今，猪的主要生产性能已有大幅度提高。瘦肉率可达65%以上；70日龄以后的日增重最高可达2000g以上；料肉比可达2.51，接近鸡的饲料利用率。,一

6、、人工授精技术给家畜育种带来的效应,二、配子低温冷冻保存技术给家畜育种带来的效应,低温冷冻保存精液技术，延长了优秀种公畜的使用年限，拓宽了优良种畜的覆盖面，扩大了优秀种公畜在家畜遗传改良中的作用。 冷冻精液的使用，使参加后裔鉴定的公畜与不同地区、不同群体的母畜交配，获得数量更多、分布更广的后代及其测定数据，从而提高对公畜遗传评估的准确性和精确度。 利用精液长期冷冻保存技术，可更经济、可靠地实现家畜品种资源的保护。,人工控制母畜发情，更准确地掌握母畜的繁殖生理周期，适时输精，大大提高了母畜受胎率。 通过同期发情处理，便于实施遗传改良措施。如实施胚胎移植、冷冻精液的输精等，都有必要进行同期发情处理

7、。 超数排卵技术的应用，可提高母畜繁殖率。 人工促进母畜性早熟，实现提前配种，可缩短世代间隔，加快遗传进展。 产后人工催情，缩短母畜胎间距，提高种畜使用效率，从而提高育种效益。,三、同期发情、超数排卵与分娩控制,三、胚胎移植与MOET核心群育种体系,MOET是超数排卵（Multiple Ovulation）与胚胎移植（Embryo Transfer）是两项相互联系的生物技术的缩写。超排是基础，胚移是手段。人们习惯将两项技术统称为胚胎移植，用“MOET”表示。 MOET在家畜育种中可实现的一般效应 扩大优秀母畜在畜群遗传改良中的作用。 利用胚胎冷冻保存技术，有效地保存家畜品种资源。 冷冻胚胎的进

8、出口，消除了家畜品种之间的地理隔离，促进优良种畜的基因交流，加速育种进程。 冷冻胚胎的传递，可获得正常情况下难以得到的育种材料。 MOET可使一些遗传素质十分优秀，但因繁殖障碍而无法妊娠的母畜延续其在育种中的作用；甚至克服种间隔离，挽救濒危动物。,MOET核心群育种体系基本流程示意图,迄今，体外受精在各主要技术环节上的效率还不够高，总体技术水平还未达到应用的要求，胚胎工程学家们正在探索新的技术途径，如供体的活体取卵技术、腔前期或小腔期卵细胞的体外培养技术等。因此，体外受精技术的全面应用尚需一段时间。但仍可预测该技术在家畜育种和生产中广阔的应用前景。,四、体外受精（在牛和羊的胚胎生产中得到部分应

9、用） （一）技术步骤：,大幅度降低胚胎的生产成本，若与超排技术相结合，可生产更多的可移植胚胎。 使优秀母畜产生更多的胚胎和后代，扩大优良基因在群体中的影响；对不小心宰了的优秀个体，还可利用其卵巢，通过体外受精继续在育种上加以利用。 在母畜更新率一定的情况下，利用体外受精生产胚胎，可降低种母畜的留种率，提高母畜选择强度，加速群体遗传进展。 在同胞测定中，应用体外受精技术可增加同胞数量，提高种畜选择的准确性。,（二）体外受精技术的应用前景,可实施一头母畜的卵母细胞用不同公畜的精液受精，产生同龄母系半同胞，利用同龄母系半同胞资料估计公畜育种值，将提高估计的准确性。 体外受精耗精量少，可充分利用数量稀

10、少而十分珍贵的种公畜的精液。 体外受精技术的应用，可打破常规的生产体系，建立新的动物生产模式。如用乳用家畜生产肉用品种。 体外受精技术的应用，可为克隆和转基因操作提供大量胚胎。,（二）体外受精技术的应用前景,（一）性别控制的效应 提供更多表现限性经济性状的个体（如母牛、母鸡、雄鹿等），对性别影响生产性能的畜种（如猪、肉牛、家蚕、马等），则能多生产雄性动物，提高动物生产的专门化程度和生产效率。 对广泛使用人工授精技术的畜种，公畜饲养量有限，则可通过性别控制增加母畜数量，提高母畜选择强度，加快母畜遗传进展。 通过性别控制实现不同阶段对公母比例的需要。在杂交育种中，不同阶段对公母比例的需要不同。如，

11、肉牛杂交育种的初始阶段需要更多的杂种母牛，而在横交固定阶段则需要选育一定数量的公牛，生产群中希望有更多的公牛用于肥育。,五、性别控制与胚胎性别鉴定,（二）性别鉴定的作用 性别鉴定后可对单胎动物实施同性别双胚移植，提高生产效率。 性别鉴定是胚胎克隆的必要技术环节。胚胎克隆之前，首先要进行胚胎性别鉴定。,五、性别控制与胚胎性别鉴定,克隆（Clone）的作用：由克隆获得的个体在遗传上是同质的（不考虑细胞质遗传）或基本同质的，因此克隆技术只能实现基因型的复制，而不能使一个群体的基因库得到创新或扩充。 实现克隆的途径：胚胎分割、胚胎细胞中卵裂球细胞核的移植、体细胞的核移植。,六、克隆技术,胚胎克隆及其应

12、用前景,1、获得更多的胚胎，进一步提高MOET及其核心群育种体系的效率。理论上，一个32细胞期的供体胚胎，经过两次克隆即可得1024个胚胎。 2、获得数量很大的遗传同质个体，为遗传效应、参数估计和育种值估计提供更准确的信息，提高估计的精确度。 3、在MOET核心群育种体系中，快速建立具有特定基因组合的多个纯系。 4、迅速推广胚胎克隆家畜，提高生产总体水平。,现阶段，胚胎克隆还有许多技术问题有待研究解决。但可预期，5-10年后这项技术将达到应用水平。其应用的潜在领域有：,尽管这项技术获得成功的报道屈指可数，达到应用水平的时间也尚难预测，但动物遗传育种学家们仍十分关注这项技术的发展，并潜心研究它对

13、未来家畜遗传育种产生的效应。由于体细胞克隆可产生已知基因个体的复制品，且移植所需细胞核来源不受限制，其意义远大于胚胎克隆。,体细胞克隆,体细胞克隆的技术难度远大于胚胎克隆。,该技术与其它胚胎生物工程技术结合，可建立最佳遗传资源保护模式。如挽救濒危动物、克隆已绝灭了的物种、冷冻保存优秀个体的克隆胚胎等。 体细胞克隆获得的遗传同质个体是比胚胎克隆更好的遗传学研究材料。 体细胞克隆可最大限度地增加优质高产个体在群体中的数量，提高畜群总体水平；同时提高生产的一致化程度，便于管理和标准化生产。 体细胞克隆产生的遗传同质个体，是动物营养、基础医学、药物学等领域最好的试验材料。 该技术为发展其它生物技术提供

14、了最佳手段。如解决转基因动物的传代难问题 。,体细胞克隆潜在的应用领域,第三节 基因工程技术的应用,生产转基因动物 进行基因诊断 研制基因疫苗 分子遗传标记 应用前景,一、生产转基因动物,（一）转基因动物的概念 转基因动物是指将体外重组DNA（rDNA）移植到成熟卵泡中，使rDNA整合到核基因组中发育而成的动物个体。 生产转基因动物的目的是使整合到动物核基因组中的rDNA高效表达，改变受体的生理特征或产生新的功能。,提高生产性能。如通过转生长激素基因或生长激素释放因子基因，可提高动物生长速度；转外源半胱氨酸生物合成基因羊，其羊毛生长速度大幅度提高。 提高产品质量。如转乳球蛋白基因奶牛和奶山羊，

15、其奶中的乳蛋白构成受到改变，大大提高了奶的质量和价值；再如，将调控蛋白结构基因转入羊或蚕中，可以改变羊和蚕支持蛋白的合成，改变羊毛或蚕丝成份，提高其质量。 实现抗病育种。如转外源Mx-基因猪具有强抗流感病毒能力；转乳铁蛋白基因奶牛，具有很强的乳房炎抗病力。,（二）转基因动物的价值,制造生物反应器。比较成功的是乳腺生物反应器，利用奶牛或奶山羊获得在乳腺中生产对合成药物有重要意义的肽或蛋白质。目前研制生物反应器的主要目的基因有：人凝血因子、抗胰蛋白酶、胰岛素、人体白蛋白、干扰素等。 为医学试验提供实验动物，建立毒理试验、玩症研究和治疗等的动物模型。如，生产对致癌物质、诱变剂、毒物等敏感的转基因动物

16、，有助于对环境危险因素的认识；制备用于人类脏器移植的转基因猪。,（二）转基因动物的价值,成本高。转基因的成功率极低，约为0.06%；转基因动物为半合子，传代不稳定；转基因的表达率低，甚至不表达；转基因品种无专利保护。 转基因动物具有负面效应 外源基因的导入可能诱发基因组中其它基因突变、失活或激活致癌基因，造成遗传缺陷或个体致死； 载体DNA表达产生的负作用，如反转录病毒载体DNA的非生理性表达，扰乱正常生理功能； 转基因本身的负作用，如转人生长激素基因鼠，其生长速度提高、乳腺发育提前、母鼠繁殖力降低甚至不育等。,（三）转基因动物的缺点,基因诊断的技术手段：PCR（Polymerase Chai

17、n Reaction）、RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphisms）、SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism）等技术。 基因诊断的目的 为育种提供配种方案。 实现对种畜的基因型选择，在选育群中淘汰有害或不利基因。,二、基因诊断,基因诊断技术已在猪、牛、羊育种中得到了广泛应用。目前能诊断的基因主要有： 猪的氟烷基因（Hal）、雌激素受体基因（ESR）、酸猪肉基因（RN）、生长激素基因（PGH）等； 牛的双肌（Double Muscling）基因； 羊的产羔数（Booroola）基因等。 现以猪的

18、Hal基因为例来介绍基因诊断的技术要点及其在育种中的应用。,基因诊断技术应用情况,基因诊断的技术环节,nn,Nn,NN,四川省三大外种猪及新荣系氟烷基因分布,CC,CC,CC,CC,CC,CC,CC,AA,AC,AA,AC,BC,CD,三、研制基因疫苗,伪狂犬病基因工程苗 伪狂犬病基因缺失苗 大肠杆菌基因缺失苗K88、K89,（一）遗传标记的概念及其发展 概念：遗传标记是指那些可准确鉴别、能反映个体特异性的遗传特征。 遗传标记应具备的条件： 具有丰富的多态性； 数量多，且覆盖整个基因组； 等位基因间呈共显性，能准确判别所有可能的基因型； 其测定不受年龄、性别、环境等因素的限制。 遗传标记的发展

19、：形态学标记 细胞学标记 生化标记 DNA分子标记。,四、分子遗传标记,RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphisms）：指用同一限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，所获得的含有同源序列的酶切片段在长度上存在的差异。这是最早开发的DNA标记，在同一基因座上只有两个等位基因，多态性不够高，且测定方法比较复杂，近年已很少使用。 AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms）：用特定引物，通过PCR反应，复制并扩增不同个体基因组DNA模板，所得DNA片段在长度上的差异。该方法较RFLP简单，但需要设计和合

20、成特定引物，且AFLP标记可能是显性的，无法区分纯合子与杂合子。,（二）DNA分子标记的类型,RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）：这也是基于PCR的分子标记，用随机序列组成的寡核苷酸作为引物通过PCR反应获得的长度不同的多态性DNA片段。该方法的重复性性较差，且多数RAPD标记为显性标记。 SNPs（Single Nucleotide Polymorphisms）：指单个核苷酸突变而产生的多态，只有两个等位基因。虽其多态性不高，但在基因组中SNP的数量很大。如人类基因组中，单核苷酸突变的概率为10-6左右，人类基因组约含30亿个碱基，因而平均每10

21、00个碱基就有1个以上的SNP标记。测定SNP最快速准确的方法是用DNA芯片技术。,（二）DNA分子标记的类型,VNTR（Variable Number Tandem Repeat）：在真核生物基因组中存在许多串状重复序列，如CACACA 或GTGTGT ，由于重复单位在个体间有很大差异，因而可作为一种遗传标记，不同的重复次数就构成不同的等位基因。按重复单位大小可分为微卫星标记和小卫星标记。微卫星标记（Microsatelite Marker）的重复单位在6个碱基对以内，或称简单序列重复（Simple Sequence Repeat，SSR）。小卫星标记（Minisatelite Marker

22、）的重复单位大于6个碱基对 。对DNA的微卫星多态性，可设计特定引物通过PCR加以鉴别。对小卫星多态性，可用重复单位的同源序列作为探针进行RFLP分析。,（二）DNA分子标记的类型,微卫星标记：M5 PCR扩增及电泳结果,ABI遗传分析程序检测微卫星标记图谱,图中共有7个微卫星标记，获得PCR产品后，用ABI遗传分析技术20分钟获得的结果。该图谱还可进行群体的精确系谱鉴定，即通常讲的亲子鉴定。该技术还可以用以进行遗传病的基因诊断。 目前正在研究一次获得20个以上标记的程序，已经通过初步实验。,分子标记为我们提供了非常丰富的遗传育种信息，这些信息可用于： 用于QTL检测； 用于标记辅助选择； 研

23、究品种起源与发展； 用于标记辅助基因的导入； 标记辅助杂种优势的利用； 标记辅助遗传资源的保存； 亲子鉴定等。 其中前3项是目前家畜遗传育种中研究得最多的内容，可望在家畜育种中得到广泛应用。,（三）DNA分子标记的作用,概念：QTL（Quantitative Trait Loci）理论上是指所有影响数量性状的基因位点。实际上，通常是将那些有较大效应的、可被检测出的基因或染色体片段称为QTL。当一个QTL就是一个基因时，该基因就是主效基因。若对影响数量性状的各个单基因都有清楚的了解，将大大提高对数量性状选择的有效性的准确性，同时还可利用克隆、转基因技术等对群体进行遗传改良。 QTL检测的方法：主

24、要有标记-QTL连锁分析法（Marker-QTL Linkage Analysis，又称基因组扫描法）和候选基因分析法（Candidate Gene Approach）两种。,1、QTL检测,标记-QTL连锁分析,以回交试验设计为例来说明M-QTL连锁分析,该研究通过组建 F2 分离群体，构建了鸡RAPD连锁图谱，用区间作图分析法，对鸡19种产肉性状基因位点（QTL）进行定位和效应分析。 连锁图谱包含32个RAPD标记，分布于5个连锁群；检测到控制17种产肉性状的QTL 35个，控制鸡胫长的主效基因2个。该论文在畜牧兽医学报发表，全国家禽研究会交流，引起同行专家高度重视。, 鸡产肉性状与分子标

25、记的连锁分析,标记-QTL连锁分析法的优、缺点,优点： 成功率高。 可检测出基因组中所有的QTL。因为标记覆盖整个基因组。 缺点: 成本高，耗时长。因测定标记基因型及个体数多。 统计分析难度大。方法及计算复杂，统计量的分布不确定，对多性状、多染色体分析时犯型错误的概率大。 很难精确定位。只能给出QTL位点的一个估计值或一个置信区间。 不便应用。实际育种群多为远交群体，标记与QTL间的关系因家系而异，用标记-QTL连锁分析找到的QTL很难直接用于这些群体。,候选基因法,候选基因：已知在性状发育或生理过程中具有某种生物学功能并经测序的基因，这些基因可能是QTL基因。 候选基因法：从一些可能是QTL

26、的基因中筛选出QTL的方法。,采用候选基因法对猪产仔数分子标记及其效应的研究结果,通过对ESR、PRLR、FSHR和RYR1四个基因与猪产仔数间的关系及第八号染色体上的 9 个微卫星分析研究，初步确立了三个新的猪产仔数分子标记： 雌激素受体基因（ESR）第八外显子内的ESRB酶切位点。 促卵泡生长激素受体基因（FSHR）第七外显子的FSHRB酶切位点。 猪第八号染色体上的SWR1101微卫星。,ESR基因的BB基因型； ESRB酶切位点的AA型； FSHRB酶切位点的BB型； 猪催乳素受体(PRLR)基因的AA基因型； RYR1基因的BB基因型等。 用这5个分子遗传标记选择母猪，群体窝平产仔数

27、可提高2.2头。,对提高母猪产仔数有利而不影响仔猪生长的分子标记有5个,ESR基因的AA基因型； ESRB酶切位点的BB型； FSHRB酶切位点的AA型； PRLR基因的BB基因型； 微卫星SWR1101的BD基因型。,对提高母猪产仔不利的分子标记也有5个,候选基因分析法的优、缺点,优点 统计检验效率高。只要是QTL，就能检测出来。 应用范围广。只需一个世代的群体，结果可用于任何群体。 成本低，容易实施。因为是对单个基因进行分析，而非对整个基因扫描。 便于应用。一旦确定某个候选基因就是QTL，可直接用于遗传评估，而不必借助其它标记信息。 缺点 不能找出所有的QTL。 难以确定候选基因就是QTL

28、。除非候选基因的效应非常大，否则其效应很有可能是与其连锁的一个或几个相邻QTL之间连锁不平衡造成的。所以在候选基因的效应未被明确证实之前，不能轻易下结论,1）标记辅助选择的基本原理 最理想的情况是基因辅助选择通过测定QTL基因型，直接选择理想基因型的个体。如猪的Hal基因 ESR基因 RN基因、羊的Booroola基因、肉牛的Double Muscling基因等。 标记辅助选择（Marker Assistant Selection）：当QTL的基因型不能直接测定，只能根据标记信息推测时，就可根据与QTL紧密连锁的Marker进行选择。,2 标记辅助选择（MAS）,标记辅助选择的前提,若M与QT

29、L在传代过程中有可能发生重组，就会导致选择错误。因此，进行标记辅助选择的前提条件是： 父亲在Marker和QTL上都必须是杂合子； 父亲的Marker和QTL的连锁相已知； 能准确判断后代从父亲处获得了哪个Marker等位基因（母亲的Marker基因型是纯合子）。,MAS的优越性,增加遗传评定的准确性 进行早期遗传评定 降低遗传评定的成本 获得更大的遗传进展和育种效益,MAS的基本策略A,保持现行的育种方案，但同时利用标记信息、表型信息和系谱信息对个体进行遗传评定。,2）标记辅助选择的策略,MAS的基本策略 B,两阶段选择,2）标记辅助选择的策略,MAS的基本策略 C,早期选择,2）标记辅助选择的策略,QTL效应的大小。 Marker与QTL的连锁程度。 选择的世代数。 常规选择的效率。常规选择非常有效，则标记辅助选择的效应不显著；反之，常规选择效率越低，则标记辅助选择的优势越明显。,3）影响标记辅助选择的效率的因素, 利用微卫星DNA标记分析四川乌骨鸡种群的遗传多样性,利用家禽基因组中的10个微卫星标记，对四川6个乌骨鸡种群的等位基因频率、各群体的遗传杂合度、群体间的遗传距离等进