无菌检查法及其验证

1、无菌检查法的概念是药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅助材料及其他品种的一种方法。 如果供试品符合无菌检查法的规定，供试品只是显示在这个检查条件下没有被微生物污染。 无菌检查法的概念是，无菌检查是根据目的检查微生物在培养基中的生长来判断结果的。 无菌检查只能提示这个批次的产品被污染的程度。 无菌检查合格只是说明被检样品是无菌的，不能证明整个样品是无菌的。 无菌检查设施、环境、人员，检查环境必须在清洁度10000级、局部清洁度100级的个别流空气区域内或隔离系统内进行，其全过程必须严格遵守无菌操作。 隔离系统根据相关要求进行验证，其内部环境洁净度必须满足无菌检查的要求。 无菌检查设施、环境、人

2、员，规定定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法现在的国家标准进行洁净度验证。 在日常检查中，还需要监视试验环境。 无菌检查设施、环境、人员、无菌检查员必须具备微生物的专业知识，接受无菌技术的训练。 无菌隔离系统、无菌隔离系统是不受外界环境影响，可以进行无菌操作的独立环境系统。 使用隔离系统的优点：可以持续地创造高效的高度无菌空间，保护产品不受外来污染，包括作业人员、作业环境及外包装等污染，确保作业环境及实验物品的表面能达到无菌要求，防止假阳性结果的产生，保证无菌实验结果的可靠性，实现一次检测要求。 保护操作者不受实验中有害物质的影响，放置隔离器的环境洁净度没有特别的要求，

3、具有容易移动等优点。 根据HTY无菌隔离系统、无菌检查用培养基的种类和用途、硫乙醇酸盐流体培养基-好氧菌的培养、厌氧菌的改良马丁培养基-真菌和好氧菌的选择性培养基-硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方和制法，在培养基灭菌或使用前使用适量的中和剂或表面活性培养基的配制和装量、培养基可以按处方配制，也可以使用符合该处方生产规定的脱水培养基。 硫代乙醇酸盐流体培养基的装量和容器高度的比率，培养结束后的培养基氧化层(粉色)不要超过培养基深度的1/2。 在接种样品前，培养基的氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5。 否则，在100水浴中迅速冷却直到粉红色消失(20分钟以内)，只加热一次。 培养基的储

4、藏、调制的培养基，应该保存在2-25、遮光的环境中，如果保存在非密闭容器中，通常在3周内使用的密闭容器中，一般可以在1年内使用。 请根据实际情况进行验证，确定培养基的有效期。 培养基的适用性检查，本检查可以在样品无菌检查前，或与样品的无菌检查同时进行。 无菌性检查重要性：培养基无菌不合格会导致实验假阳性结果。 检查：一次培养基必须随机提取5根以上或5根以上，硫代乙醇酸盐流体培养基在30-35下培养，改良马丁培养基在23-28下培养，培养14天，无菌生长。 培养基适用性检测，灵敏度检测菌种硫代乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌生菌、绿脓菌、枯草芽孢杆菌改良马丁培养基的适用性检测，菌种选择原则的代表

5、性、普遍性、易生存、非病原性、标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。 代表金黄色葡萄球菌(代表革兰氏阳性菌)、绿脓菌(代表革兰氏阴性菌)、枯草芽孢杆菌(代表药品中最常见或容易污染的菌)、球孢菌(代表厌氧菌)、念珠菌(代表酵母菌)、曲霉菌(代表霉菌)。 菌种要求：不能超过五代。 用合适的菌种保存方法保存，保证菌种的生物学特性。加菌量：100cfu。 培养基适用性检测，菌液调制试验菌培养基培养温度培养时间黄色葡萄球菌营养肉汤30-35 18-24绿脓菌枯草芽孢杆菌产生菌硫代乙醇酸盐流体念珠菌改良马丁培养基23-28 24-48黑曲霉改良马丁琼脂斜面5-7日， 培养基的适用性检查培养基接种试验菌每安装

6、量的接种量培养时间金黄色葡萄球菌硫代乙醇酸盐12 ml 2根1 ml 3日绿脓菌枯草芽孢杆菌产生菌白色念珠菌改良马丁培养基9 ml 2根1 ml 5日曲霉其中硫代乙醇酸盐和改良马丁培养基1根以未接触为空白的种子量100cfu (不可多)、培养基的适用性检测，结果表明空白对照应在无菌条件下生长，如果装有菌的培养基管均良好生长，则该培养基的灵敏度检测符合规定。 试验应同时进行空白对照，说明培养基仅限于无菌检查培养基支撑生长的微生物。 微生物种类很多，这些微生物有营养、温度、氧等广泛的生长要求。 无菌检查培养基并不支持所有微生物的生长，选择了支持最有可能被污染的药品和药品中生长的微生物营养的培养基。

7、 供试品的无菌检查法、无菌检查法包括直接接种法和薄膜过滤法。 只要样品性状允许，必须优先采用薄膜过滤法。 对样品进行无菌检查时，采用的检查方法和检查条件必须与验证方法相同。 薄膜过滤法能提高无菌检查的检出率，特别是抗菌性供试品，采用薄膜过滤法能有效地去除供试品的抗菌性，提高检出率。 作为供试验品的无菌检查法的直接接种法，样品直接移入无菌培养基。 各容器中培养基的使用量，接种的供试品的体积不得超过培养基体积的10%。 同时，硫代乙醇酸盐流体培养基的每管安装量改进了15ml以上，马丁培养基的每管安装量改进了10ml以上。 培养基的用量和高度用同样的方法验证了试验。 在各培养基上接种的管数与供试品的

8、检查数相同。 供试品的无菌检查法薄膜过滤法，原理：薄膜过滤法将供试品通过过滤膜，将微生物关在过滤膜中，同时用清洗液清洗有抗菌作用的药品(有残留就抑制微生物的生长)，然后培养过滤膜观察微生物的生长。 选择过滤器的材质时，考虑到供试品及其溶剂的特性，在过滤水溶性供试液之前先过滤少量的冲洗液，然后湿润过滤器。 油类是供试品，过滤器和过滤器在使用前必须充分干燥。 使用时请保证过滤器在过滤前后的完整性。 供试液经薄膜过滤后，需要用冲洗液清洗过滤膜时，每张过滤膜的清洗量为100ml，清洗量为1000ml以下，避免过滤膜上的微生物受到损伤。 请优先选择密闭型薄膜过滤器作为过滤器)，也可以使用常用的薄膜过滤器

9、。 过滤器孔径为0.45m以下，直径约为50mm。 供试品的无菌检查法、检查数量是指，使用薄膜过滤法将一次检查中使用的供试品的最小包装容器的数量增加1/2的最小检查数量作为阳性对照，在供试品的无菌检查时，增加每个培养基容器接种的样品的量作为阳性对照。 所谓检查量，是指一次试验中使用的供试品的总量(g或ml )，每一个供试品(瓶)的安装量足以按照规定接种2种培养基的情况下，必须分别接种硫代乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。 采用薄膜过滤法时，检验量应少于直接接种法供试品的总量。 在供试品的特性允许的范围内，必须过滤所有容器内的内容物。 无菌检查稀释液、冲洗液、无菌检查使用的稀释液、冲洗液的种类

10、对微生物无毒、无抑制作用。 稀释液的使用量、冲洗液的清洗次数及使用量等必须与验证合格的方法一致。一个过滤器的一次清洗量是100ml，总清洗量不要太大(不超过1000ml )，使用量过多不仅容易破坏被过滤器捕获的微生物，而且容易损伤过滤器，但不要太少。 不那样的话，就不能把供试品清洗干净，去除抗菌性。 0.1%胨水溶液PH7.0氯化钠-胨缓冲液可以根据需要加入表面活性剂和中和剂，验证其有效性，不会影响细菌生存。 供试品溶液的制备，水溶液供试品取规定量，直接过滤，或混合到含有适量稀释液的无菌容器中，搅拌后立即过滤。 供试品含有抗菌作用和防腐剂时，必须用适量的冲洗液清洗过滤膜，清洗次数必须在3次以上

11、。 清洗后，使用密闭型薄膜过滤器，将硫代乙醇酸盐流体培养基100ml和改良马丁培养基分别放入对应的滤筒中。 采用一般的膜过滤器，取出过滤器，将其三等分，分别放入含有50ml硫代乙醇酸盐的流体培养基和改良的马丁培养基容器中，将其之一作为阳性对照用。 向样品中供给规定量的可溶于水的固体制剂，加入适当的稀释液溶解，或者用标签说明溶解，然后用水溶液按样品项目下的方法进行操作。 -内酰胺类抗生素的供试品取规定量，用水溶液或固体制剂的供试品的处理法处理，过滤，用适当的冲洗液洗净过滤膜。 再用含有适量-内酰胺酶的冲洗液接种去除了滤筒和过滤器上残留的抗生素的培养基，根据需要可以在培养基中加入少量的-内酰胺酶，

12、或者将过滤器直接放入含有适量的内酰胺酶的培养基中。 接种培养基的方法是用供试品项目下的方法操作水溶液。 供试品溶液的制备，非水溶性制剂供试品取规定量，直接过滤或混合，溶解于山梨酯80或其他含有适当乳化剂的稀释液中，充分混合，马上过滤。 用含有0.1%-1%的聚山梨80的冲洗液至少清洗3次过滤器。 过滤器在含有或不含有多山梨糖醇80的培养基中培养。 培养基接种是用水溶液按试验品项目的方法操作的。 其他种类的供试品：含有可溶于十四烷酸异丙酯的膏和粘性油剂供试品无菌气体(喷雾)喷雾剂供试品药物的注射器供试品带有导管的医疗器具(输血、输液包等)供试品、供试品溶液的调制、阳性对照试验的目的：供试品灭活后

13、培养条件是否满足要求？ 必须根据供试品的特性选择阳性对照菌。 抗菌和抗革兰氏阳性-金黄色葡萄球菌抗革兰氏阴性-大肠菌抗厌氧菌-芽孢杆菌抗真菌-念珠菌阳性对照菌的增加量： 100cfu阳性对照培养48-72h应良好地生长。 阴性对照不加样品无菌检查的目的：确认无菌检查使用的稀释液、冲洗液、培养基、青霉素酶、集菌器等物品和人员的操作，检查环境、仪器设备等是否存在菌。 请用同样的方法操作适当的溶剂和稀释剂。 应该在无菌检查的同时进行。 阴性对照不允许细菌生长。 培养和观察样品无菌检查的培养温度和时间非常重要，微生物能在适当的温度和时间内生长。 培养14天，培养基浑浊，培养14天后不能从外观判断菌是否

14、生长的情况下，最好用同种培养基和线将该培养液适量移植到斜面培养基，培养细菌2天，培养真菌3天，观察无菌的生长，或用镜子检查判断。 结果表明，判断前提：阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，无菌检查者有效。 供试品管全部清晰的情况下，或者被证实有浑浊但无菌的成长的情况下，判断供试品符合规定。 供试品中的任一根浑浊，确认菌的生长时，判断供试品不符合规定。 除非充分证明，生长的微生物不包含在供试品中。满足以下至少一个条件时，如果无菌检查试验中使用的设备及环境的微生物监测结果不满足无菌检查法的要求，则可以判定试验结果无效，回顾无菌试验的过程，在发现了有可能引起微生物污染的因素的供试试管中生长的微生物被鉴定后

15、如果确认考试无效，请再试一次。 在重试时，重新尝试等量的供试品，依法重试，无菌生长的情况下，判断供试品符合规定，细菌生长的情况下，判断供试品不符合规定。 如果供试品符合无菌检查法的规定，供试品只是显示在这个检查条件下没有被微生物污染。 所有供试品管均无菌生长，可判断供试品符合规定。 除非有充分的证据证明检测出的微生物不是样品本身，以一次检测为标准，原来的检测结果无效，必须再试一次。 无菌检查的界限本版药典无菌检查法只是显示，如果供试品满足无菌检查法的规定，则供试品在该检查条件下没有被微生物污染。 药品是无菌的还是无菌的？ 药品是否无菌的结论，以药典规定的无菌检查的采样和试验方法的结果作为判断的

16、依据。 无菌检查有很多限度，最明显的是无菌检查方法本身。 不管样品中是否有好的代表，其结果总是有不确定性。 这是一个破坏性的实验，与批量整体随机样本的统计选择性有关。 无菌检查的界限，理论上应该确定某一批产品的无菌性，对每个容器进行无菌检查。 但是无菌试验会破坏样品，所以不能检查最小包装的产品。 统计概率界限：对于低污染水平的产品，其界限在统计学上是明确的。 检测条件的限制：样品中被污染微生物的检测受到各种因素的影响，只有在各种检测条件符合污染微生物的修复和生长条件时，才能保证被检测样品无菌检测结果的正确性。 污染检测率低于实际产品的污染率，无菌检查可能有检查错误：由于污染菌浓度过低、污染菌生

17、长缓慢或培养基不良等原因，培养过程中污染菌可能完全不生长。 产品的染菌率越小，误判定合格的可能性越大。 无菌检查的另一个缺点是，在无菌检查中发现阳性结果时，可以根据规定再研究。 尽管在复查时适当增加了样品的数量，复查的概率还是更低了。 因此，在评价某无菌产品某一批的无菌状态时，只有最终产品的无菌检查是不够的，界限很大。 对无菌产品来说，生产最终产品的所有系统的技术是最重要的。 抽样由于无菌检查法有统计学限度，所以对同一批无菌分注产品，尽可能地提取批量生产的开始和结束或生产过程中发生异常时的产品构成样品进行检查。 对于采用最终灭菌的产品，提取每个灭菌库验证的灭菌有可能不完整的产品构成样品进行检查

18、。 试验结果被判定为无效时，再试的样品必须尽可能在与第一次试验相同的时间分注，或者检查相同灭菌位置的样品。 休息一下，关于方法验证考试，为什么要验证？要验证什么？ 怎么验证呢？ 为什么采用经验证、验证的方法是分析测量科学的基本要求，是遵循各种法规工作的基础。 药品微生物检查作为药品质量体系的一部分，和其他检查项目一样，必须考察方法和条件，保证结果的科学性，如鉴别、含量测定。 验证思想其实已经贯彻在微生物检测的多个方面：无菌环境验证(尘埃粒子、浮游菌、沉降菌检测)、灭菌器的验证、培养基敏感性检测、阴性对照、阳性对照等。为什么验证，药典充分借鉴发达国家的经验，对微生物检验方法的验证实验提出了更系统的