基因编辑技术38275.ppt

1、a，1，基因编辑技术，背景定义，原则分类和比较CRISPR的优点和将CRISPR基因编辑技术应用于植物育种的一般程序，a，2，继续开发和改进全基因组测序技术实现大规模基因组测序工程，基因革命(基础科学和个性化医学间转换)，将大量数据转换为功能和临床相关知识但是该技术的应用中存在一些限制因素，包括基因工程组件插入对象部位的效率低下的方法、审查过程中可能会产生耗时费力的突变效果的情况等。RNAi基因目标敲除技术为研究人员提供了进行快速、低成本、高吞吐量研究的新方法，但是RNAi的基因敲除效果还不彻底，每个测试和每个实验室的测试结果都有差异，而且还存在不可预测的目标情况，因此只能用于需要暂时抑制基因

2、功能的测试。基因编辑技术(近10年出现):是一种基因编辑技术背景，研究人员通过操纵多种细胞和多种生物体内的几乎所有基因，大大提高艾滋病患者对HIV的抵抗力。2014年3月12日，宾夕法尼亚大学巴勃罗特拜斯教授组在新英格兰医学杂志上发表了一篇文章，他说：“Sangamo BioSciences开发的，1，不同种族之间自由的“转换”，基因编辑技术首次应用于临床。目前，Sangamo生物科学以ZFNs技术为基础，将艾滋病治疗进入临床试验第二阶段。免疫细胞表面的CCR5蛋白是HIV进入免疫细胞的“入口”。少数北欧人由于CCR5基因的“变异”(最初来自高加索)，具有天然的HIV抵抗力。“你不把病人的CC

3、R5基因改为高加索种族类型吗？”！“关闭一个基因，打开生命之门，2015年11月5日，Waseem Qasim使用Cellectis的tanes基因编辑技术改造的UCART19细胞株，缓解了Layla的不治之症-急性淋巴细胞白血病(ALL)，创造了世界上第一个婴儿白血病治疗奇迹，基因编辑技术是人类技术中有史以来第二个。”修改捐赠细胞，产生抗癌效果。蕾拉的生命获救，多亏了基因工程修改的血液细胞。捐赠的血液细胞来自美国，科学家们对其全部进行了三次修改。科学家们首先将抗白血病基因添加到捐赠的血细胞中，以定位和杀死癌细胞的蛋白质为目标，接着科学家们利用tal ens技术关闭两个基因，关闭第一个基因，防

4、止捐赠的细胞被蕾拉的身体拒绝，关闭第二个基因，是为了防止捐赠的细胞被治疗剂杀死。a，5，3，“只有恢复受损的基因才能看到光”，2015年11月3日在剑桥大学举行的EmTech上，Katrine Bosley在实验室数据中表示，CRISPR基因编辑技术被称为Leber congenital amaurosis(LCA；Editas将于2017年进行CRISPR基因编辑人类实验。Editas发表的2017人体实验很有趣，因为in vivo基因编辑考试是第一次。这项研究成功的原因在于，如果将CRISPR基因编辑“工具”装入病毒，并在感染部位注射该病毒，CRISPR就可以在引起该病的部位自行进行基因操

5、作。然后，如果治疗像Layla这样的白血病，不分离t细胞，直接将变形的病毒注入骨髓，然后直接修复基因异常的骨髓，或者直接整合目标基因，增强其战斗力。那样的话，很多大手术将变成微创手术，得到的好处将是不可估量的。Editas的CEO Katrina Bos ley，a，6，2是基因组编辑器技术，基因编辑意味着删除和插入DNA核苷酸序列。也就是说，通过基因编辑技术，人们可以按照自己的意愿重写DNA由脱氧核苷酸写的生命之书。a，7，基因编辑技术的原理，构建人工编码，从预定基因组位置切割DNA，切割DNA，在细胞内DNA修复系统修复过程中产生突变，实现了基因组定点转换的目的。DNA恢复系统主要有两种方

6、法，DNA双链断裂(DSB)，即非homologous end joining，nhej和同源重组(homologous recombination，)通过这两种还原途径，基因组编辑可以进行基因敲除，引入特定突变和定点转基因，a，8，1)基因敲除：如果想失去某个基因的功能，就在这个基因中植入DSB，在修复NHEJ的过程中经常插入或删除DNA(indel)，从而实现基因敲除。(2)引入特定突变：要将特定突变引入基因组，就必须通过同源重组来实现，这时必须提供包含特定突变的同源模板。(。正常情况下，同源重组的效率很低，在这个部位生成DSB可以显着提高重组效率，从而允许引入某些突变。(3)定点转基因：

7、与特定突变引入的原理相同，在DSB还原过程中，将复制到基因组的基因转化添加到同源模板中间。a，9，3，基因编辑技术分类，第一代人工核酸内聚酶：锌是核酸内聚酶(zinc finger endonuclease，ZFN)，锌是能够结合DNA的蛋白质种类，人类细胞中大约一半转录因子包含锌指结构第二代人工核酸内切酶：相似转录激活因子效应核酸酶的出现极大地取代了ZFN(转录激活因子)。TALEN可以对像TALEN这样复杂的基因组进行细微的改造，同时构建简单，特异性高，受到科学研究者的瞩目。2012年，达人被ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for geno

8、me engineering杂志评为十大科学突破之一。第三代人工核酸内切酶：以规则间隔群集的短回文重复序列-Cas蛋白(clustered regular spaced short pallindromic repeats(crispr)/crispr-associated(crispr-associated)，a，10，图b:锌表示核酸酶二聚体和DNA结合的示意图。锌在核酸酶的目标序列中包含两个锌指蛋白结合部位，但这两个部位之间有57bp的间隔，锌指向核酸酶的Fok I酶切域，就可以切割其间隔序列。当然，也可以设计只识别左右结合部位的锌指蛋白。ZFN: Cys2-His2锌指蛋白质，图a:锌

9、由大约30个氨基酸组成，形成保守结构。锌指螺旋结构表面的那几个氨基酸可以与DNA沟中的三个碱基相结合，但其结合的选择性是多种多样的。因为有高度保守的链接序列，所以可以设计识别9到18个碱基长度的DNA序列。由680亿个碱基组成的一个DNA序列中有18个碱基的序列足以成为一个特定序列，因此，如果能够设计出含有超过3个锌指蛋白DNA识别域的蛋白质，科学家就意味着能够利用锌指蛋白识别人类基因组中的任何DNA序列。a，11，TALE蛋白的DNA结合域由一系列重复域组成，每个重复域由33到35个氨基酸组成，每个氨基酸识别一对碱基。TALE nuclease的DNA结合特异性主要由两个可变氨基酸决定，科学

10、家称这两个核心氨基酸为重复可变的双氨基酸残差部位(repeat-variable di-resides，RVD)。就像锌指向结构域一样，这个TALE重复模块也串联起来，以识别长的DNA序列。塔伦分子比ZFN大得多，很难有效地引入，科学家也想出了很多方法，例如金门分子克隆技术(“golden gate”mollection cloning)。TALEN，a，12，crispr/Cas系统，CRISPR/Cas系统的操作特性类似于CRISPR/Cas系统的操作特性有限的核酸内聚酶，对序列的特定切割主要是由crRNA和Cas蛋白形成的核蛋白复合物，与目标序列的PAM根据CRISPR/Cas系统的特性

11、，用于设计用于修正我们感兴趣的基因座的人工核酸内啡肽(EEN)。在三种CRISPR/Cas系统中，type 系统的核蛋白复合物比较简单。除了crRNA和tracrRNA，Cas9中只有一种蛋白质。目前生产猪链球菌SF370的type 系统是最成功的人工核酸内酶。a，13，其基因座结构可分为三部分。5端为tracrRNA基因，中间为Cas9，Cas 1，Cas2，Csn2，3端为CRISPR基因座，启动子区和很多间隔顺序和重复顺序，CRISPR/Cas的基因座结构，a，14，CRISPR/Cas的作用机制(理解为步骤3):phase I，phase ，phase iii，a，15，噬菌体获得新的

12、间隔顺序可以分为三个阶段。首先识别入侵的核酸，扫描外源DNA潜在PAM，使用接近PAM的序列作为proto spacer候选。在CRISPR基因座的5 端合成重复序列。最后一个新间隔序列合并在两个重复序列之间(图2)。目前只确认了第一步。第一，CRISPR的不同间隔获得，a，16，第二，CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后成熟):多项研究表明，CRISPR基因座首先转录为前体CRISPR RNA(前crRNA)，然后转录为Cas蛋白或此小RNA是成熟的crRNA，由间隔序列和部分重复序列组成；TypeCRISPR/Cas系统crRNA的成熟除了Cas9和rnasiii的参与外，还需要tr

13、acrRNA的指导。a，17，第三，CRISPR/Cas系统活性或外源遗传物质的干扰：成熟的crRNA与特定的Cas蛋白形成核蛋白复合体，与外源DNA结合，扫描到外部DNA，寻找上面的目标序列，crRNA的间隔序列与目标序列互补配对。外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割。早期研究认为，crRNA的间隔序列(spacer)和外源DNA的目标部位的完美互补是切割所必需的，但后来的研究发现，间隔器和蛋白质分子的部分互补成对时也是可以切割的。a，18，2013年，Thomas gaj，Charles a. gers Bach，Carlos f.barbas.zfn，talen，and cr

14、ispr/cas-based memestrend in biotechnology，09 may 2013doi 3360 10.1016/j . tibtech . 2013 . 04 . 004，a，19，crispr/ca S9，ZFNs，TALENs的比较，功能结构：ZFNs，TALENs序列特异性由每个多肽的DNA结合域确定，剪切由FokI酶域确定。CRISPR/Cas9系统由单单体蛋白和嵌合RNA组成，序列特异性由gRNA中的20个碱基序列决定，切割由Cas9蛋白完成。设计难度：锌由于蛋白质和DNA相互作用的复杂性和序列特定的附加限制，一般认为ZFNs的设计很困难，费用高，其专利

15、受一些商业公司控制。商业ZFNs比使用公共资源设计的ZFNs有效，但要贵得多(例如，美国的sangamo bisoscisences (Richmond、ca、USA)是美国sigmaaldrich(ST . Louis、mo、USA)talence在蛋白质重复和DNA序列之间有一对一的识别规则，而且像golden gathen克隆等高效的DNA组装技术简化了talence组件的组装，因此设计起来更容易，但是talence非常重复的序列在体内会引起同源重组现象。法国巴黎的Cellectis Bioresearch(未验证的自定义TALEN的价格为3360美元，验证为5000美元)，美国的Transposagen bio pharmace uticals(Lexington，KY，USA)gRNA领导的剪切只依赖于与目标DNA序列简单的Watson-Crick碱基对，因此不需要对每个目标部位进行复杂的蛋白质操作，只需修改GRNA的