IPP 分析免疫组化图片

1、用image-pro plus (ipp )分析免疫组织化图像，1 .由免疫组织化图像的分析原理、染色染料的颜色浓淡和分布面积大小决定目标蛋白质的量。 染色区域的分布面积与目标蛋白质质量成比例。 染色颜色浓淡和目标蛋白质质量的定量关系符合朗伯-比尔定律，是对数关系。 1.1光密度和灰度迷惑人的不同概念，光密度：吸收光物质的光学密度。 (optical density，通称od值)光密度值与染色物质的量直接相关。 灰色：灰色不是黑色，而是反射亮度的单位。 电子照片上像素的亮度称为灰度。 gray : between white and black example :1.thebrityve值on

2、displayscreenisgrayvalue.2.thedardarvalueonawhitepaperisalsothegray 光吸收物质的光学密度.被测定物质的量越多，光密度(od值)越高，透过的光越少，在照片中反映得越黑。 od值与物质的量直接相关，数字图像上的点的灰度值与对应物质od值呈对数关系，符合朗伯维尔定律。 理论上，od值从零到无限大。 在实际应用中，od值的范围通常是0-2.0或0-3.0。 如果odd值正确，分光光度计和酶测定器的测定值是odd值透过的显微镜图像上的光强度即使用odd值蛋白质电泳带测定也是odd值。 关于荧光显微镜和荧光分光光度计的测定值，用eb染色荧

3、光强度(fluorescencepensityintensity )的dna凝胶电泳带也是荧光强度，但处理方法与光密度相同，因此也使用了od值。 这个od和之前的od有不同的意思。 荧光的光密度。 反映了荧光物质的量。 处理照片时使用灰度，各种图像被拍摄为照片进行数字图像处理时，计算机测量并计算照片的灰度。 为了定量物质的含量，最后有必要转换成od值来表示。 免疫组织化照片的分析结果应该是od值、光密度。 不应该是灰度的。 正确地，分析免疫组织化照片的特定染色区域的灰度，测定组织切片的光密度值。 另外，可以使od值与样本量在标准样本中相关联，od值为无单位的相对值。 使用酶测定器或分光光度计时

4、，请制作标准曲线。 定量分析电泳带时也同样制作标准曲线。 电泳条纹照片的灰度值与样品量的关系是指数函数。 将灰度值转换为零值时，不正确地通过一个基准点进行定量分析。 由于多个基准点的标准曲线也有很大的误差，所以只能说是半定量分析。 1.2定量分析的指标： iod (integrated option density )和mean density，将图像上各点的光密度值相加，得到iod。 这个值与目标物质的总量成比例。 iod值除以有效目标分布区域的面积得到mean density，该值反映了目标物质每单位面积的浓度。 在对样本照片进行数字图像分析并比较时，比较它们之间的平均光密度值的大小。 1

5、.3张照片染色物的品质差异，2张照片染色深度相同，染色面积大，2张照片染色物的品质差异，2张照片染色区域的面积相同，染色深度大，品质大，这次应该怎么看，a的颜色浓，面积小。 b的颜色浅，面积大。 比较体积！尺寸、光密度、1.4实际图像情况复杂。 阳性样品染色深，阴性样品染色浅。 直接比较整个图像的iod和比较整个图像的mean density一样，哪个染色物多？ 染色区域颜色深度接近，染色面积不同。 根据area可以得出不同的结论，结合切片的情况进行判断。 iod对整个图像的面积进行平均。 iod对特定组织区域的面积进行平均。 iod平均了发色的组织区域。 另外，图像整体的区域很少被平均，在该

6、图像中，黄色的iod值主要来自中央区域。 右上空白区域的面积应该扣除。也许是这个特定的组织领域。 这个区域是特定的染色区域。 虽然在计算iod时可以同时计算，但将其作为平均面积通常不正确。 与单一细胞的分析相比，单一细胞的iod单一细胞的mean density照片上的各细胞iod或mean density的平均值、边界不清楚的带壁细胞、照片整体iod/细胞数(照片中细胞数少，数起来不费事)、细胞簇的分析、照片整体的测定细胞分布的区域面积area。 数被蓝色染上的核，作为细胞数n。 以iod /(n )作为统计指标。 或iod/area，2 .从照片中分析光密度的方法的技术进步，简单地测量照片

7、整体的光密度值。 在照片上随机选择几个区域，测定其光密度值。 将其平均值作为照片整体的光密度值来计算。 在照片上正确选择被染料染色的特定颜色的区域，计算这些区域的累积光密度值(iod )，进而计算统计区域的平均光密度值。 2.1测定照片整体光密度的图像分析装置，其测定原理与分光光度计相似，直接测定切片整体光密度。 显然，可以根据照片上的像素点的亮度来区分测量区域的缺陷。 再染色的其他颜色的染料也引起光密度的吸收，引起严重的干扰。 2.2样品测定光密度，在彩色电子照片上选择目标色的区域，采样测定这些小区域的灰度值，将其平均值作为比较染色浓淡的指标。 可以随机选择几个区域，可以“随机”吗？2.3

8、imagepro plus的独特优点。 然后根据颜色标准选择aoi(areaofinterest )。 测量这个区域的光密度参数。 使用ipp比前面两种方法更好。 另外，在调查文献中使用的图像解析方法为前两种情况下，可以替换为ipp的解析计测。 结果会变得更正确。 没有必要原封不动地采用文献中所记载的方法。 随着计算机技术的发展，今后可能有更好的图像分析方法和图像分析程序。 3 .用ipp分析免疫组织化图像的过程，拍摄样品照片。 选择图像上具有染料色调的区域(aoi，areaofinterest )。 测量此区域的iod。 选择有效统计区域的面积进行测量，计算光密度的平均值iod/area(m

9、ean density )，计算同一实验组切片的各照片的平均值和标准偏差。 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间是否有显着差异。 3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍摄与普通的显微镜照片不同，用于免疫组化分析的显微镜照片有特殊的拍摄要求。 将显微镜光源、显微镜光源准确调整为日光色温的白色光。 此时加入蓝色滤光器，灯丝电压为9v左右。 一般的显微镜有指示。 此时镜子下的视野明亮眩目。 不能通过调整聚光透镜的光圈来降低亮度，会影响光学系统的分辨率和图像的清晰度。 灰度太大，不能降低亮度. 用25%的nd过滤器返回。 nd滤光器的6%经常引起颜色失真。 照明光源不白色时，有偏振

10、，直接影响照片的颜色，测量结果不正确。 固定显微镜的工作条件，不仅是光源的亮度，除了在更换样品时调节载物台的位置以外，其他部件都是固定的。 特别是，请勿交替切换使用倍率不同的物镜。 使用一个物镜拍摄了所有照片后，切换到另一个物镜拍摄照片。 为了保证显微镜的光源稳定，必须一次拍完所有的照片。 不能拍几次。 如果能给显微镜接通稳定电源就更好了。 由此，显微镜光源的亮度稳定。 必须使用手动控制曝光的相机。 相机必须对每个照片使用相同的曝光时间，而不是自动控制曝光。 染色深的阳性样品必须拍摄得很暗。 染色浅阴性对照样品应该很亮。 决定了各种拍摄条件后，必须使用这个条件一次拍摄所有的照片。保证曝光一致。

11、 控制相机的曝光时间，控制相机的曝光时间，使视野中的空白部分变得雪白。 拍摄的照片中，没有组织的空白的背景灰度值应该是230左右。 使用图像分析软件，可以测量空白的背景灰度值。 小于230的背景灰度值容易产生色偏差，影响图像解析值的偏差。 背景的灰度值也不应该太高。 使空白灰度值为230以上相当于用分光光度计调节100%透过。 背景的影响，左图：暗蓝色背景对阳性区域的色调有很大的影响。 降低黄色点的iod值。 这对分析结果有很大的影响。 有些相机具有手动校正色温的功能，可以校正背景的色调，但暗的背景即使颜色不偏差也会影响分析结果。 注意，暗的背景值对分析结果没有影响、显着差异、显着差异，按下背

12、景后也没有显着差异，误差线也变大了，依然没有显着差异，无法使用照相机的自动白平衡，自动白平衡功能根据照相机整体的颜色状况自动对各照片进行白平衡处理这对分析测量的准确性有很大的影响。 显微镜照片被一两种染料染色，照片的颜色应该不平衡，无法校正。 现在用专业的ccd拍摄比较好。 民用数码相机适合拍摄日常生活的照片，自动曝光、自动白平衡功能能有效地改善照片的直观效果。 但是，在显微镜照片中，这些功能改变了照片的原来姿态，每个照片都使用不同的拍摄条件。 对照片的分析、测定结果有很大影响。 关闭这些功能通常需要复杂的设置。的。 虽然自动白平衡校正不可用，但在拍摄前必须通过手动白平衡校正背景色。 拍摄照片

13、时，校正相机的背景色，使拍摄照片中的空白背景变白。 这个比较适用于所有拍摄的照片，与自动白平衡完全相反。 关于自动白平衡，最好对每个照片应用不同的颜色。 必须将照片保存在可逆压缩形式tiff中。 特别是染色浅的图像，如果保存为jpeg形式，就会失去亮度的细节，测量误差会增大。 注意那些马赛克，总结拍摄注意事项：调整显微镜光源的亮度(电压9伏)，充分白，充分亮。 调整相机的曝光时间，使背景变白。 灰度值最好在230以上。 确认相机没有使用自动白平衡功能。 但是，使用手动校正白平衡的功能，将背景色校正为白色。 使用相同的显微镜工作条件和相机工作条件(曝光和白平衡的设定)，一次拍摄所有的照片。 以t

14、iff格式保存照片。 素颜不必那么大。 3.2用image-pro plus分析免疫组化图像。 与photoshop不同，image-proplus是一种图像分析和定量测定软件。 ipp的功能不是为了美化图像，而是在照片效果差或分析结果差的情况下，从切片处理和拍摄过程中寻找原因，不通过图像的改变和处理来解决问题。 基于ipp的分析测量必须正确反映图像本身的实际测量数据。 3.2.1开始使用ipp。 ipp的程序界面是典型的windows风格。 其中包含一些最常见的windows程序通用的工具。 进入ipp的第一件事是打开要分析的图像。 将分析图像信息保存在数据库中，将分析图像过程信息保存在程序

15、中，是保存实验原始数据的基本原则，必须遵守。 将图像信息、图像分析过程和分析信息存储在ipp程序数据库中，是保存实验原始数据的操作。 请注意，对同一图像进行相同的操作。 由于手动操作不正确地重复，同一测量可能会产生两次不同的结果。 这也是保存测量结果的理由之一。 3.2.2进行光密度值的比较。另外，在光密度值的校正中，如前所述，电子照片上的像素点的强度由灰度值来定义，对8位数字图像最明亮的白色的灰度值是255。 最暗的黑色灰度值是0。 这与免疫组织化染色的光密度值(od )相反，因此需要修正。 将灰度值大的白色定义为光密度值=0定义灰度值最小的黑色光的密度值为无限大。 为了容易计算，通常将纯黑

16、点的光密度值设为2.0或3.0。 因为光密度值和灰度值的变换关系符合朗伯-比尔定律，所以是对数关系。 光密度正的另一个作用是减去背景。 照片的白背景的灰度值(光的密度值)大多小于255，将小于255的值定义为光的密度零点，实际上是画背景。 正规的光密度值为正，理论上，应该制作已知量的标准样本(空白样本、标准样本系列、全黑样本)，使光密度值为正。 可以得到更正确的分析结果。 在实际工作中，制作标准的东西非常麻烦，很难制作正确的东西。 实用性不是那么高。 切片染色过程的影响因素太多，难以正确控制。 因此，最后的分析测定结果仍然属于半定量分析。 选择3.2.3测定参数和分析指标分析免疫组织化图像时，

17、一般要测定选定特定颜色区域面积和累积光密度(iod )免疫组织化的显微镜照片，一般要分析平均光密度。 必须根据实时iod/area .图像的特征，分别测定选择区域的iod和area .组织照片，用不同的测定指标进行比较。 ipp可以测量各种几何尺寸和光密度指标，并根据需要进行选择。 在这个过程中，还可以设置数据过滤器的限制，以去除干扰性无效的测量数据。 3.2.4挑选特定的检测对象(objects )，一般免疫组织化样品中黄色区域为阳性染色区域。 测量时，需要测量这些黄色(茶色)区域的光密度值。 不测量其他颜色的部分。 因此，第一个课题是选择这些黄色区域。 ipp根据图像上像素点的颜色，自动选

18、择要测量的区域。 使用segmentation工具。 对于色差小的图像，也可以使用手动aoi工具定义要测量的区域。 用ipp选择特定的颜色的区域并选择特定的颜色的区域是ipp的最特征的功能，基于特定的颜色的特征选择图像中的特定的区域，计算这些区域的面积等几何尺寸和光密度数据是ipp分析图像的工作的中心作用。 segmentation :用于选择整个图像中具有特定颜色的所有区域。 irregular aoi:手动选择目标区域的工具。 irregular aoi工具是手动工具。 a :跟踪方法，手动或自动查找区域边界，b:magic wand方法，定义特定灰度范围的区域。 segmentation工具：完全基于颜色标准选择相同颜色的多个区域，测量并导出3.2.5统计结果数据，测量指标：1 .分析整个图像的所有对象的iod累计值(iod sum) 2.区域面积(area sum )。 该区域可以是图像整体的面积，也可以是图像内的特定区域的面积(可以与iod的测定