氨基酸类神经递质含量测定PPT课件.ppt

1、氨基酸类神经递质含量测定,1,一、样品处理,方法1【高效液相色谱法检测小鼠脑组织中氨基酸类神经递质 】 脑组织称重，加入 9倍体积的甲醇/水，冰浴匀浆；离心，上清液低温保存。 衍生化反应：小脑组织液加入乙睛，混匀离心，取上清液加入 NaHCO3和2,4 -二硝基氟苯，混匀，暗中衍生 (水浴 65 )，进样。,2,方法2【反相高效液相色谱荧光法测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质】 脑组织称重，加入生理盐水，冰浴匀浆；离心取上清液，加高氯酸，同时加内标，混匀离心，取上清液，加K2CO3 溶液，离心，上清液备用。 衍生化反应 ：预处理好的样品加入OPA衍生液混匀 ，室温静置，进样。由于氨基酸荧光衍生产

2、物不稳定 ，尤其是 Gly和 GABA ，故在衍生化时需严格控制反应时间。,3,方法3【高效液相色谱法快速测定氨基酸类神经递质】 脑组织称重，加入高氯酸匀浆，精确加入内标液，混匀低温离心，上清液备用。 衍生化反应：上清液加入KHCO3和丹酰氯丙酮溶液，混匀置于 80 水浴下 30 min，取出后加醋酸丙酮溶液终止反应，冷却进样。,4,方法4【发育期大鼠海马氨基酸类神经递质的研究】 脑组织称重，加入无水乙醇冰上匀浆，离心两次，将上清液过滤分装， - 70 保存。 衍生化反应：加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液，超声震荡摇匀，70 水浴10 min，低温高速离心20 min ,上清液尽快进样检测。,5,方

3、法5【高效液相色谱 - 质谱 - 质谱法测定脑组织中氨基酸类神经递质】 脑组织称重，加入 HCl，冰浴超声粉碎, 匀浆液加入内标，离心取上清加入甲醇，振荡 30 s，离心，上清液备用。 衍生化反应：组织液60 加热并 N2吹干，取出后加入盐酸正丁醇，60 衍生化反应 30 min。60 加热并 N2吹干，残渣用甲醇-醋酸铵水溶液溶解，过滤后待用。,6,二、测试方法,方法1【高效液相色谱荧光法同时测定小鼠脑组织中4种氨基酸类神经递质 】 液相色谱仪系统：购自日本岛津，RF-10AXL荧光检测器 色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX C18柱(4.6 mm 150mm，5m)，采用梯度洗

4、脱。流动相A为甲醇，流动相B为醋酸钠缓冲液。柱温30，进样量20L。 荧光检测波长：激发光波长为 340 nm，发射光波长为 450 nm。 0 . 625-5mol /L浓度范围内线性关系良好,7,方法2【高效液相色谱法检测小鼠脑组织中氨基酸类神经递质 】 美国 waters 2695 高效液相色谱仪、UV检测器及色谱数据处理系统。 色谱条件：Diamonsil C18色谱柱(4 .6200nm，5m)；流动相A 为醋酸钠缓冲液，B为乙睛-水。柱温：28，进样量20L，采用外标法定量。 紫外检测波长为 350 nm 。 0.01 -1的g/mL范围内线性关系良好,8,方法3【高效液相色谱法快

5、速测定氨基酸类神经递质 】 检测限Asp，Glu和Gly为0.2g/L GABA为0.5g/L LC-10AD高效液相色谱仪，RF- 530荧光检测器。 色谱条件：色谱柱为 Kromasil C18 (4.6 250 mm，5m) ；流动相为甲醇/醋酸钠。进样量20L；柱温为室温。 荧光检测波长：激发波长为 360 nm；发射波长为 500 nm。 1-200 mg/L范围内各组分线性关系良好,9,方法4【发育期大鼠海马氨基酸类神经递质的研究 】 检测限 Glu=10.5 g/mL,Asp=16.3g/mL,GABA= 10.6g/mL,Gly=8.8g/mL VARIAN Prostar 2

6、10 高效液相色谱仪； VARIAN Prostar 325 紫外检测器。 色谱条件 ：反相色谱柱(ZORBAX XDB C18 4.6250 mm，5m , Agilent) 。流动相 A : 醋酸钠-乙腈溶液；流动相 B :乙腈-水溶液，进样量 20L。 紫外检测波长 254 nm。 氨基酸含量在 0.027-0.6312 mg/ml 线性关系良好,10,方法5【反相高效液相色谱荧光法测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质 】 检测限Asp、 Glu和 GABA为 0. 01mol/ L，Gly为 0. 02mol/ L。 Agilent 1100 高效液相色谱仪，荧光检测器配备 3D 色谱工作

7、站。 色谱条件：色谱柱为 Hypersil ODS C18 (4. 6 250mm，5m，日本 GL 公司)，流动相：磷酸二氢钾缓冲液/ 甲醇/乙腈，柱温 40 。 荧光检测波长：激发波长为340 nm，发射波长为 455 nm。 在 0.5-40mol/L 浓度范围有较好的线性关系,11,方法6【大鼠脑纹状体微透析法研究天王补心方剂中桔梗的应用】 检出限：Asp，Glu 为0.46g GABA，Gly 为0.23g Agilent 1100型高效液相色谱仪，Agilent l046A荧光检测器 色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS C18柱。流动相为磷酸缓冲液/甲醇，梯度洗脱；柱温20

8、。 荧光检测器：激发波长340 nm，发射波长450 nm。 Asp、Glu含量小不在线性内，主要测定GABA、Gly在0.08-1.28 mg/L线性关系良好。,12,方法7【柱前在线衍生-反相高效液相色谱内标法快速测定饲料中氨基酸 】 Agilent 1100 高效液相色谱仪；G1321A荧光检测器 色谱条件：Zorbax Eclipse AAA C18柱色谱柱；754. 6 mm，3. 5m；流动相A为NaH2PO4H2O缓冲液；流动相B为乙腈/甲醇/水，梯度洗脱。 DAD检测波长：紫外波长338 nm；FLD检测波长：激发波长340 nm，发射波长450 nm。 线性范围为 4.5-1

9、000mol/L,13,方法8【高效液相色谱-质谱-质谱法测定脑组织中氨基酸类神经递质】 Agilent 1100 高效液相色谱仪; 美国 ABI Q TRAP质谱仪 色谱条件：预柱为 ZORBAX S B- C8(2. 112. 5 mm，3. 5 m)，连接 Waters公司 Symmetry C18(2. 150 mm，3. 5 m)色谱柱。流动相为乙腈-甲醇-醋酸铵水溶液，进样量为 5L。 质谱条件：电喷雾电离源，正离子方式检测，扫描方式为多反应监测。 GABA及Asp 在 0.1-0.8mol/mL, Glu 在0.4-1.2mol/mL线性关系良好,14,方法9（气相色谱质谱法）

10、（1）检测到甘氨酸【基于气相气谱-质谱的代谢组学方法研究四氯化碳致小鼠急性肝损伤】 6890N/5973N气相色谱-质谱联用仪；Agilent ZB-5MS毛细管柱；进样口270，进样2L，接口270，离子源230，电离电压：70eV，四级杆150，氦气载气，全扫描。 （2）检测到甘氨酸，谷氨酸【气相色谱-质谱联用法分析手印残留物中氨基酸的研究】 GCMS-QP5050(日本岛津公司)，色谱柱为DB-5MS；进样口温度280 ，连接口温度230；氦气载气；分流比20：l；进样1L 。,15,桂莉，田洪，郑健高，等. 高效液相色谱荧光法同时测定小鼠脑组织中4种氨基酸类神经递质J. 第三军医大学学

11、报, 2009, 31(8):675-678 刘萍, 何新荣, 周文斌, 等.大鼠脑纹状体微透析法研究天王补心方剂中桔梗的应用与抑制性神经递质变化的相关性J.中国中药杂志, 2008, 33(23):2830-2833 宋泰. 高效液相色谱法检测小鼠脑组织中氨基酸类神经递质J. 吉林农业科技学院学报, 2009,81(4):18-20 吴强恩,郑力行,谢芳,等. 反相高效液相色谱荧光法测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质J.复旦学报(医学版),2005,32 (3):355-358 黄晓,康学军,肖静, 等. 高效液相色谱法快速测定氨基酸类神经递质J.检验医学 2006, 21(3):215-218 谭来勋 ,孙圣刚 ,王细林,等.发育期大鼠海马氨基酸类神经递质的研究J .Stroke and Nervous Diseases, 20