液相色谱的基础知识及应用

1、HPLC的基础知识和应用，2007年10月26日，工业催化剂和反应器设计实验室内部学术交流活动，徐帅，Contents，5，样品分析方法的建立，液相色谱的维护和注意事项，软件的简单介绍和演示，1液相色谱的发展历史和分类， 1.1色谱的起源(1903 )，M.S. Tswett iupac定义ofchromatography(1993 ) : chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponenttobeseparatedaredistributebetweentwophases enofwhichisstation ndef

2、ineditedirection .固定相(stationary phase ) :在色谱分离过程中固定并保持在样品中的相。 移动相位：将采样向前移动的另一个相位。 色谱：利用不同成分和两相(固定相和流动相)之间的力(分配、吸附、离子交换等)的差异，当样品在两相中相对移动时，各成分在两相之间多次平衡，使不同物质相互分离的一种物理化学分离方法。 利用1.2色谱的定义、1.3色谱的发展过程、1.4色谱的分离过程、色谱的分离过程、咖啡、流动相、固定相、混合物中各成分在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异，两相进行相对运动时， 各成分为两相，多次受到上述各作用力而相互分离，1.5色谱分类不

3、同流动相物质量：气相色谱(Gas Chromatography，GC ) :使气体流动相(也称载气)液相色谱LC :使液体以固定相的形态使用：平面色谱薄层色谱，流动相和固定相的相对极性的正相色谱固定相的极性为反相色谱更大的固定相极性比流动相小，HPLC和GC的应用差异，HPLC和GC的应用差异，挥发、非挥发、疏水性、亲水性、糖、环氧化合物、多氯联苯、脂肪酸甲酯、芳香酯、C2/C5烃、无机离子、氨基酸甘油三酯、磷脂、亚硝胺、有机磷杀虫剂、醇多环芳烃、芳香族胺、脂溶性维生素、抗体、天然食用色素、类黄酮、抗生素、腈类、抗氧化剂、乙二醇、脂肪酸、磺胺类、挥发性羧酸、醛苯酚、黄曲霉毒素、酶、糖醇、2 .

4、色谱法的基本原理色谱的主要理论热力学理论在相的平衡观点上代表了色谱过程的搁板理论(Martin Synge ) 动力学理论代表了各种动力学因素对色谱峰的影响Van Deemter方程，Martin，Synge，正在研究分离原理的样品成分的固定相和流动相之间的分配流动相， 由于样品在柱不同成分和固定相间相互作用的强度不同成分向固定相的移动速度不同，分离分配系数KD Xm Xs KD1=Xs/Xm Ym Ys KD2=Ys/Ym，流动相、固定相、形成样品成分的分离的样品、分配、移动、流出、分离、KD2 KD1， y先流出，分配系数k、分配系数与成分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有

5、关。 条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度低(Cs、Cm小)时，k依赖于成分的性质，与浓度无关。 这是理想状态下的色谱条件，在该条件下得到的色谱峰为正常峰的多数情况下，随着浓度变高，k减少，此时色谱峰随着作为尾部峰的溶质浓度变大，k也变大因此，必须尽可能减少样品量，降低列内的成分浓度，将k设为一定，才能得到正常的峰。 在相同的色谱条件下，样品中k值大的成分在固定相滞留的时间长，然后流出柱的k值小的成分滞留时间短，柱先流出。混合物中各成分的分配系数越大越容易分离，所以混合物中各成分的分配系数不同是色谱分离的前提。 在HPLC中，固定相确定后，k主要受流动相性质的影响。 在实践中主要

6、通过调整流动相的组成配比和pH值，获得了成分间分配系数的差异和适当的保持时间，达到了分离的目的。 样品成分的分离状况如下： a .样品和柱固定相没有任何作用的3种样品在t0小时内流出，没有保持时间的b .样品成分的保持时间与柱的力相同c .样品成分的保持时间不一致的样品成分和柱的力不同d .实际的分离状况高斯分布曲线， 色谱显示峰形状，实际的峰形状是高斯分布曲线样本的扩散效果，是无扩散、样本扩散、分离度、分离度的相邻两个峰的分离程度。 用两个成分的保持值之差和平均半值宽度之比表示：R=？ 你觉得时间的两个高峰分离了吗？ 不同分离度r、相邻两个吸收峰的分离度r=1.0、98%、基线分离r=1.5

7、、99.7%r=1.5时，完全分离(中国药典规定)的两个色谱峰被视为分离，分离度r的数学表示为分离度r的基本式k:容量因子(cc 是吸收峰保持特性：选择因子(selectivity factor )反映相邻两个色谱峰的分离程度、色谱过程热力学因子N:理论级数、柱的分离效率的色谱过程动力学因素，是列效应、选择因子、电容因子、 测定溶质在固定相和流动相中分布的摩尔数(量)的比是温度关系(GC )和流动相溶剂的种类和组成关系(LC )、k在决定样品进入柱固定相的量k过小的固定相上的保持过短，马上流出，保持时间k过大，在固定相上的保持过强，溶出时间长理想的k为15，分离效果和k值的优化，k值的优化改变

8、溶剂成分、梯度条件(溶出强度)，选择因子，将柱分成两组的能力为1时，两组的分离表示两组之间平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互力的差异。 选择、t0，tR1，tR2，Injection，因子的影响因子，包含使流动相成分变化，使pH值变化，使柱温变化(LC不明确)固定相成分变化，使用特殊的化学效果， 理论板数n搁板理论热力学平衡理论柱效应的定量分馏法技术导出的分馏法根据成分挥发性分馏色谱法根据成分分配系数分离出分配系数K=Cs/Cm理论板数n， 搁板高度h柱效应随着n的增大和h的减少而增加分配色谱的过程模型，理论级数n、半峰宽W1/2和保持时间的关系如下所示，在相同的保持时间，色谱的峰值越尖，

9、柱效应越高，分离性能的优化增加、容量，增加选择因子增加k值则分离度增加，但分析时间增加，改变流动相、固定相成分的增加值则分离度增加，但对k值没有影响，液相色谱设备的概要液相色谱装置的构成、溶剂输送系统(泵系统)、样品系统、检测器、站、成分液相色谱装置的结构图、流动相储存瓶、单元或多泵、倾斜混合器、预柱、手动-样品自动-样品器、保护柱、柱后反应器、柱温箱、计算机、接口、温度控制单元、样品制造单元完成纯化的方法是：稀释，相互溶解，用比流动相弱的溶剂或流动相本身稀释样品进行过滤-提示有不同孔径的过滤材料。 暗示了：的化合物吸附在过滤器上可能会影响定量。 可以去除离心-样品中的粒子物质。 采用萃取-液

10、萃取、固相萃取挥发-惰性气体对样品进行鼓泡或抽真空以去除溶剂，优化概要，优化应由系统进行，也就是说，各参数必须阶段性地变化。 啊！ 每次执行只能变更一个参数！ 啊！ 以在最短的分析时间内得到最高的分离结果为目标，优化了溶剂强度、流速、温度、柱长、固定相*，流动相的选择原则上：样品容易溶解，溶解度尽可能大。 化学性质稳定，不伤害柱子。 不妨碍检测器的检测，对紫外波长没有吸收。 粘度低，流动性好。 从其中容易回收样品。 无毒或低毒，操作方便。 高纯度，也就是说容易变得色谱纯。 废液容易处理，不污染环境。 反相色谱中最常用的流动相及其清洗强度，H2O甲醇、乙腈、乙醇、四氢呋喃、正相色谱中常用的流动相

11、及其清洗强度的顺序，正己烷醚乙酸乙酯、异丙醇、系统填料粒度)- 4.6 x 250 mm 5 m使用适当孔径的初始运行，符合流动相组成条件的pH )优化k* (保留)梯度范围，时间斜率流动相-微小变化)优化回收率样品的溶解性温度作用结合相的作用有机修饰子)优化* (选择性)温度耦合相pH (最后手段)优化n (卡流速长填料粒度、分离度与k、n、和的关系、梯度范围、斜率、流速、填料粒度、柱长温度、流动相、pH、色谱的定性分析、色谱定性分析：将保持值定性和色谱并用技术(例如LC-MS、LC-FTIR )作为但是，相反的结论不成立，即在相同的色谱条件下，具有相同保留值的两种物质不一定是相同的物质，使

12、用已知物直接对照进行定性分析的绝对保留值定性，一般来说， 用自动样品相对保留值定性用已知物增加峰值的法定性要求采用文献值对照进行定性分析的保留指数(I )测定检测器信号响应和时间的关系测定各峰值的保持时间、色谱的定量分析、检测器信号响应和时间的关系测定各峰值的峰值面积， 定量分析的基本式： mi成分的量Aii成分的峰面积fi i成分的校正因子与检测器的行为和被测定成分的行为有关。 定量分析的根据是，被测定成分的量与响应信号成比例，但相同含量的物质由于物理、化学性质的不同，同一检测器产生的信号也不同，因此用直接响应信号进行定量的话，必然会导致大的误差。 导入修正因子。 校正系数是定量计算式的比例

13、常数，其物理意义是用单位面积表示的被测定成分的量。 1 .面积百分法2 .外部标准法3 .内部标准法4 .正规化法、色谱定量法的种类， 面积百分法最简单的计算方法样本中所有成分对检测器的响应值相同的样本中所有成分，样本中单一成分对其他成分的含有面积%=(AI/A ) * 100 AI=单个色谱图的峰值面积A=全色谱图的峰值面积之和不要求采样量不能正确地应用于所选择的检测器，且规范化的方法必须为样本中所有分量的含量之和100%。计算其中某成分的含有率的定量方法： xi样品中的成分I的含有率fi成分I的校正因子Ai成分I的峰面积或峰高度、归一化法的例子化合物峰面积校正因子峰面积校正因子比率c 82

14、001.2240240/1708=14.12301.6368368/1708=21.52001.8360360/1708=21.13001.8540540/1708=31.61002.0200/1708=11.7 301708 %的优点：方法很简单，样本中的所有成分都需要具有峰值正规化法主要用于气相色谱的定量测定。 一般仅适用于通用型检测器。 直接峰面积归一化无校正因子法(% (NOCalibration )可以在样本中各成分的校正因子大致相等时，像同族体或异构体一样，用峰面积归一化进行定量。 即，简化为以下式：例如：不使用校正因子和校正因子的标准化法的定量结果，多点校正的定量分析，单点校正，

15、峰值面积，采样量，采样量，响应值=采样量unn=，峰值面积，峰值面积，采样量， 多点校准外部标准法(External Standard )也称为标准曲线法，在相同的分析条件下，对标准物质和样品色谱图的峰面积或峰高度进行比较。 将已知的标准品放在不同浓度的标准系列上，在与被测试样品相同的色谱条件下，准确地取样体积，测量各种浓度的峰值高度或峰值面积，绘制响应信号和百分比含量的关系曲线2 .测量样品的峰值面积或峰值高度，在标准线上测量其对外标法的定量、样品结果直接在标准工作曲线上阅读非常简单，特别适合分析大量样品。 要求样品量、色谱分析条件不发生严格变化，容易出现大误差。 以内标法(Internal Standard )、DBP为内标测定Pynamin .的标准溶液：正确称量dbp200mg和pynamin220mg90%，制备了溶液100ml。 用色谱测定得到As=12000、Ai=10000时，相对校正因子为：制备样品溶液：称量dbp210mg和220mg的样品，制备溶液100ml。 用色谱测定得到As=12500、Ai=9500时，样品中的Pynamin的含量为：因此