谷丙转氨酶活性检测

1、血清谷丙转氨酶活性的测定，1。实验目的1。掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。2.熟悉血清丙氨酸转氨酶活性测定的具体操作方法。3.了解血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的临床意义。第二，基本原理，血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)可以催化底物(pH7.4)中丙氨酸与酮戊二酸的反应生成谷氨酸和丙酮酸，丙酮酸可以与起终止和显色作用的2，4-二硝基苯肼发生加成反应生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，然后在碱性环境中，根据这一原理，血清中的丙氨酸转氨酶的活性可以通过标准曲线计算出来，或者通过与在相同条件下处理的丙酮酸的标准液相相比较而求出、*仪器1。515厘米试管，刻度移液管。2.恒温水浴、离心机和721分光光度

2、计。*试剂1 . 0 . 1摩尔/升磷酸盐缓冲液ph 7.4 0.1摩尔/升磷酸氢二钠溶液：称取14.22克na2hpo4或17.8克Na2HPO414.22g克，将其溶于蒸馏水中，稀释至1 000毫升，并储存。0.1毫升/升磷酸二氢钾溶液：称取13.61克磷酸二氢钾，溶于二氧化氢中，稀释至1000毫升，储存。将420毫升0.1摩尔/升磷酸氢二钠溶液和80毫升0.1摩尔/升磷酸二氢钾溶液混合，得到ph为7.4的0.1摩尔/升磷酸缓冲溶液。加入几滴氯仿，储存4分钟。3。仪器和试剂，2。取10毫克标准丙酮酸钠作为标准丙酮酸(含丙酮酸2.0毫升/毫升)，用上述缓冲液定容至50毫升。这种液体应该在同一

3、天使用和制备。3.谷丙转氨酶底物溶液(含2毫升-酮戊二酸和200毫升-丙氨酸)取29.2毫克-酮戊二酸和7克-丙氨酸，用试剂1溶解于100毫升中，用1毫升氢氧化钠调节溶液的酸碱度至7.4，然后稀释至刻度(因为在低于7.3或高于7.6的环境中转氨酶的酶活性降低)，加入此液体可在冰箱中储存4天。4.2.4二硝基苯肼溶液取19.8毫克分析纯的2，4二硝基苯肼，用1摩尔/升盐酸将其溶解在100毫升中，并储存在棕色瓶中。0.4摩尔/升NaOH溶液的常规制备。血清样品的制备取100毫升的鸡血，在40下放置10小时，然后离心取血清，并保存在冰箱中备用(由于血细胞中的转氨酶活性高于血清中的转氨酶活性，应防止溶

4、血；如果血清中这种酶的活性太高，可以在重复使用前将其稀释)。2.制作标准曲线。取6根干燥干净的试管，按照下表操作，得到实验结果。以吸光度值为纵坐标，酶活单位数为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。4.实验操作；3.血清样品中丙氨酸氨基转移酶活性的测定取四个干燥干净的试管，按照下表操作(血清和底物溶液预先保温10分钟):5。实验结果；1.检查标准曲线上的酶活性；2.计算：丙酮酸物质的量(摩尔)SGPT活度单位/100毫升=1000次(分)2。标准曲线上的值在20，500U时准确可靠，当其超过500 U时，应稀释样品。3.转氨酶只能作用于左旋氨基酸，而对右旋氨基酸没有影响。DL氨基酸在实验室广泛使用(

5、比L氨基酸便宜)，如果使用L氨基酸，剂量将减半。4.不应使用溶血标本，因为血细胞中的转氨酶活性很高，这将影响测定效果。5.血清样品的测定应在显色后30分钟内完成。6.预防措施6。丙酮酸标准溶液的浓度要求非常精确。丙酮酸启封后易变质为聚丙酮酸，影响丙酮酸标准溶液的有效浓度，不易检测。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准溶液。7.每批试剂的空管吸光度波动不应超过0.015A，如果超过，应仔细检查试剂和仪器的问题。8.严重脂血症、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒患者的血清样品可增加测得的吸光度，应将其用作血清样品对照管。*一个卡门单位的定义是：在温度25、pH7.4、波长340纳米、光程1cm的条件下，1毫

6、升血清可使NADH的吸光度降低0.001转氨酶活性。*国际单位：在最佳温度(25)下，每分钟产生1摩尔丙酮酸的酶的量是1个活性单位，即1IU=摩尔/分钟。* King的单位定义是：每1毫升血清与底物在37反应60分钟，产生1毫升丙酮酸作为一个单位。* Mohun方法单位定义为：每毫升血清与底物在pH7.4，37下反应30分钟，每产生2.5微克丙酮酸为1个单位。七。酶活性单位的定义。临床意义，(1)肝胆疾病：急性病毒性肝炎中，谷丙转氨酶是最敏感的指标之一，且会明显升高。慢性肝炎血清丙氨酸氨基转移酶的升高一般不超过参考值的3倍，有时可降至正常。慢性活动性肝炎血清丙氨酸氨基转移酶可升高至参考值的35倍以上。在活动性进行性肝硬化中，谷丙转氨酶可能中度和轻度升高，但在代偿期可能正常或轻度升高。原发性肝癌患者的谷丙转氨酶可正常或适度升高。当胆道疾病如胆结石引起梗阻时，虽然没有肝细胞病变，但谷丙转氨酶可略有升高。(2)其他疾病：心肌梗死和心功能不全引起的肝充血可显著增加谷丙转氨酶。骨病、多发性肌炎和肌营养不良会增加ALT活性。一些药物或毒物