酶联免疫吸附试验测AFP――ELISA双抗体夹心法

1、ELISA综合性实验二,综合性实验设计方案探讨 ELISA最佳工作浓度的选择,此次试验提供0.5mg/mL的包被抗体原液每组300l (经过一系列的预实验，现在我们抗体包被的浓度范围缩小为10g/mL 60g/mL)。 包被用Na2CO3缓冲液每组各10ml 酶标抗体稀释液、抗原稀释液每组10ml 1:50酶标抗体液每组100l（预实验后工作浓度范围缩小在1:20001:10000之内） 800g/mL的检测抗原原液每组800l（自己调整检测浓度，此次试验强阳性抗原为400g/mL、弱阳性抗原浓度为20g/mL、阴性直接加抗原稀释液 ） 聚苯乙烯酶标板条3条，共36孔,实验设计操作要求,包被抗

2、体、酶标抗体、检测抗原浓度的确立； 聚苯乙烯板条每孔加包被抗体液100L，4包被48h。 弃去孔内液体，每孔加200L封闭液，4封闭24h。 弃去封闭液，风干，检测（检测时每孔所加的各稀释度的酶标液和抗原都为100L ），结果分析。,标本检测的原理,将特异性抗体包被固相载体，加入受检标本（抗原）使之与固相载体上的抗体结合成抗体抗原复合物，加入酶标抗体形成抗体抗原酶标抗体复合物，加入底物显色。,实验材料与仪器,待检抗原原液、酶标抗体、抗原稀释液、酶标稀释液、酶标板条、洗涤液、显色液A、显色液B、终止液 滴管、吸管、微量加样器、移液管 酶标仪、温育箱,操作,在酶标板条的孔中加入相应浓度的抗原（10

3、0UL/孔） 3730min 弃孔内液体，用洗涤液洗3遍，30s/次 拍干 加所设计的不同工作浓度的酶标抗体100UL/孔 3730min 弃去孔内液体，同上洗涤三次 拍干 加底物A、B液各2滴(100UL/孔) 3715min 显色后加终止液1滴(50UL/孔) 酶标比色仪450nm读取OD 值,棋盘滴定法选择最佳工作浓度,选择标准：强阳性参考血清A值为0.8左右 阴性参考血清A值0.1 （即：选择强阳性对照孔最接近0.8，且阴性孔小于0.1的孔所对应的包被浓度和酶标浓度为最佳的ELISA检测浓度。）,实验设计要求,在实验本上绘出36孔设计图表 写出实验中选择的包被液的情况 写出实验中选择的

4、包被抗体、酶标抗体、检测抗原的浓度，和系列稀释方案。 写出最终测得的OD值并分析实验结果。,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,评价,双抗体夹心ELISA法简单易行，不需复杂的仪器设备，特异性强、敏感性高，其中一步法更简单、省时，但有Hook效应的缺点。,AbAgAb* Ab Ag Ab* Ab Ag Ag Ab*Ab* Ag Ab* a b c d,Ab Ag Ab Ag （b复合物） (1) Ab AgAb* Ab Ag Ab* （a复合物） (2),HooKS效应（钩状效应）,ELISA影响因素实验设计,第一组：边缘效应 第二组：叠加效应 第三组：温浴方式 第四组：加样方式 第五组：洗涤次数 第六组：温浴时间 第七组：试剂温度,小组讨论结束后每组写出一份具体的试验设计方案，下节课上每组派代表上台讲述实验方案和可行性，讲述时间为2-3分钟左右。 要求