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文档简介

1、1,R T-P C R 与 表 达 载 体 的 选 择,2,表达载体,表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。 表达载体是基因表达的核心元件。, 试 验 总 结 ,3,实时荧光定量PCR,实时荧光定量PCR技术(RT-PCR) 是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号的积累实时监测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,4,RT-PCR 原理,荧光阈值 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在 荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设

2、置是基线 （背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。, 扩 增 曲 线 ,5,RT-PCR 原理,CT值 是指每个反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数具有重现性。, 扩 增 曲 线 ,6,RT-PCR的数学原理,7,CT,8,PCR 反应的对照,9,PCR 反应条件, 试 验 总 结 ,10,TaqMan 探针法, 试 验 总 结 ,11,SYBR Green I荧光染料法,SYBR Green I是一种只与dsDNA小沟 结合的具有绿色激发波长荧光染料。, 试 验 总 结 ,12,SYBR Green I原理, 试 验 总 结 ,13,两种方法的比较, 试 验 总 结 ,14,荧光定量的解析方法,15,PCR 反应体系,10PCR Buffer(含Mg2+ ) 2 uL dNTPs(各2.5mmol/L) 2 uL 引物(10umol/L) 各1 uL 模板 2040 ng rTaq DNA聚合酶 0.5 U 加双或三蒸水至 20 uL, 试 验 总 结 ,16,绝对定量分析法,根据起始浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷

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