共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色.ppt

1、共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色 临床医学研究中心,德国Leica激光扫描共聚焦显微镜SP5 II简介,基本参数,型号：德国Leica SP5 II 激光器：4个 发射波长400nm-800nm 物镜：10倍 20倍 63倍 通道：多通道 多色 系统：windows 7LAS AF 活体细胞装置：配有,激光扫描共聚焦显微镜的基本特点, 观察方式：以荧光为主 光源：激光（紫外、可见光） 照明方式：点照明、逐点扫描 成像方式：共聚焦、逐点成像 输出：实时观测，数字化图像，可以进行 图像处理和定量分析 多重染色样品的观察,基本功能,多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像 采集 光学显微镜分辨率：0.2

2、5m 共焦显微镜分辨率：0.18m,基本功能, 定位、定量分析,基本功能, 无损伤、连续光学切片，显微“CT” 三维重构成像,三维重构成像,基本功能,活体细胞荧光染色的动态观察及快速扫描成像,LAS AF软件的基本界面,在生物医学中的主要应用,（一）原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 3.检测细胞凋亡 4.细胞器观察及测定 5.观察细胞骨架 6.检测细胞融合 7.检测细胞内脂肪 （二）活体细胞或组织功能的实时动态监测 1.细胞内离子动态变化的测量 2.膜电位的测量 3.细胞内PH值的测定 4.检测细胞内活性氧物种的

3、产生 5.检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位,日常保养及注意事项,按照手册正确操作。如有疑问请及时联系 Leica 工程师，寻求专业帮助。 保证外部电源供应稳定。 由于环境的变化会影响各部件的相对位等，无论工作与否请保持室内恒温，清洁，干燥。室温 22-25 摄氏度，相对湿度80%以下为宜。 使用一段时间后，精密器件可能会由于环境等因数引起偏移，为保证仪器正常使用，请与 Leica 的专业工程师联系，及时调较仪器。 使用显微镜油镜后请用无水乙醇清洁镜头前部。,日常保养及注意事项,短时间的停顿工作时，无需关闭系统。 只是做一些分析图片等工作时，无需打开激光器控制钥匙，以减少激光器的损耗。

4、请避免使用外界存储设备（U盘，移动硬盘等），以免电脑受病毒感染。 请不要安装包含杀毒软件在内的任何未经软件生产商授权和经Leica工程师认可的软件。,荧光探针的选择,选择荧光探针的主要步骤： 1、根据实验目的确定需要检测的目标； 2、确定可供选择的荧光探针的范围； 3、考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备 要求； 4、荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。,样品要求,样品经荧光标记 组织切片在载玻片上，用盖玻片封片 固定的或活的贴壁培养细胞应培养在共聚焦专用小培养皿或盖玻片上 悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片,样品要求,载玻片厚度应在0.81.2mm之间，盖玻片应光洁，厚度在0.1

5、7mm左右 标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发 尽量去除非特异性荧光信号 封片剂多用甘油：PBS混合液（9：1),激光共聚焦适用的器皿及要求,一、活细胞直接免疫荧光染色（溶酶体或钙离子）,（1）将A549细胞细胞培养于35 mm 激光共聚焦 培养皿中间的圆形凹槽里； （2）染色前吸除培养皿的培养液，用PBS洗2-3 次； （3）向培养皿中轻轻滴入Lyso-Tracker Red或 Fluo-4/AM工作液200L，使其覆盖凹槽里 全部细胞； （4）37 、5%CO2 培养箱中孵育30 min； （5）吸除染液，用PBS洗2-3次； （6）再用80

6、0L的PBS覆盖凹槽里全部细胞， 用激光扫描共聚焦显微镜观察Ca2+的变 化。,二、间接免疫荧光染色（FITC标记）,（1）收集细胞 收集细胞爬片，吸取各培养孔上清，PBS冲洗（ 5min3），4%多聚甲醛固定20min，晾干后用。 （2）通透及封闭 取出细胞爬片，贴于载玻片上，用PBS（5min3） 冲洗后，加入0.3% Triton X-100穿透细胞膜5min， PBS（5min3），加入2% BSA封闭抗原30min。 （3）滴加一抗 滴加用PBS稀释的一抗，湿盒内4孵育过夜。每次 实验均作空对照白（PBS代替一抗）和同型对照（ 兔/鼠血清或IgG亚型代替一抗）。,二、间接免疫荧光染色（FITC标记）,（4）滴加二抗 次日用PBS（5min3）冲洗后，滴加用 PBS稀释的FITC标记的羊抗兔/鼠二抗， 37孵育60 min（避光）。 （5）染核并封片 用PBS（5min3）冲洗后