高效液相色谱法(HPLC)的概述

1、这篇投稿和GC版的对应是为了更好地学习和理解LC主要内容如下：1 .高速液相色谱法(HPLC )的概要2 .高速液相色谱法的基础知识介绍(113层)3、高压液质联用HPLC的发展概况、特点和分类4 .液质联用的适用性5 .应用高速液相色谱法(HPLC )概述以高压液体为流动相的液质联用分析法被称为高速液相色谱法(HPLC )。 其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的柱中，将通过样品阀注入的样品放入柱中分离后，依次进入检测器，用记录仪、积分计或数据处理系统记录色信号或进行数据处理由于尺高速液相色谱法分离性能高、选择性高、灵敏度高、分析速度快、应用范围广(

2、样品不气化，只需制成溶液)、色谱柱具有可重复使用的特点，中国药典中5.0类中药饮片的量化分析采用该方法，成为测定中药饮片制剂含量最常用的分析方法和高速液相色谱法法根据固定相可分为液体-液质联用法和液体-固体色谱分析法法根据色谱分析法原理，可分为分配色谱(液-液质联用)和吸附色谱法(液-固色谱分析法)等。目前，化学键色谱分析法的应用最为广泛，在液体液质联用的基础上得到了化学基发展。 将固定液的官能化学基结合到载体上形成的固定相称为化学键合相，其特征是不易流失，一般认为具有分配和吸附两种功能，以分配作用为主。 C18(ODS )是最常用的化学键相。根据固定相和流动相的极性不同，液体液质联用又分为正

3、相色谱分析法和反相色谱，流动相的极性小于固定相的极性时称为正相色谱分析法，主要用于极性物质的分离分析的流动相的极性大于固定相的极性时称为反相色谱，主要用于无极性物质或中极性物质的分离分析。在中药饮片制剂的分析中，多采用反相结合色谱分析法。系统配置：(1)高压输液系统由罐、脱气装置、高压输液泵、过滤烟嘴、梯度溶出装置等组成。1 .油箱由玻璃、不锈钢、氟塑料等耐腐蚀材料制成。 储液罐的设置位置高于泵体，保持输液的静压差，使用过程密闭，防止蒸发引起的流动相组成的变化，也能防止气体的侵入。2 .流动相流动相中常用的以甲醇水或乙腈水为底剂的溶剂体系。流动相在使用前必须脱气。 否则，气泡容易逸散到系统的低

4、压部分，气泡的产生不仅影响柱分离效率，还影响检测器的灵敏度，不能正常工作。 脱气的方法有加热回流法、抽真空法、医学超声脱气法和上线了真空脱气法等。3 .高压输液泵是高速液相色谱法的重要零配件之一，完成流动相的运输任务。 对泵的要求是耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出产水量范围宽，流速一定，泵体清洗和维护方便。 高压输液泵分为恒压泵和恒流泵两种，常使用恒流泵(其压力随系统电阻而变化，产水量不变)。(2)样品系统对常用的六通阀样本进行取样，样本量由定量环决定。 在操作时，首先将进样器的驾驶盘放置在采样部位(LOAD )上，此时采样口与定量环相连，处于常压状态，用微注射器(体积必须大于定量环体积)注入样品

5、溶液，样品停留在定量环上。 接下来，将驾驶盘转动到采样部位(INJECT )，将定量环装入输液管，样品从高压流动相带入柱中。(3)管柱由柱子和填充剂组成。 柱形管多为不锈钢制。 柱内填充剂有与硅凝胶化学键合的固定相。 化学结合固定相有十八烷基硅烷结合硅凝胶(也称为ODS柱或者C18柱)、辛基硅烷结合硅凝胶(C8柱)、氨基化学基或者氰基结合硅凝胶等，在中药饮片制剂的量化分析中主要使用ODS柱。 ODS是非极性固定相，分离分析中一般使用极性移动相，因此属于反相色谱。 一般的流动相有甲醇水和乙腈水等，洗脱时极性大的成分先洗脱柱，极性小的成分后洗脱柱。(4)检测器在高速液相色谱法中主要使用紫外检测器(

6、UVD )，分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器3种，可变波长紫外检测器的应用最为广泛。 检测器由光源、流通池和记录器组成，其工作原理是进入检测器的成分有选择地吸收特定波长的紫外光，其吸收率与浓度的关系符合光吸收的规律。介绍高速液相色谱法的基础知识(113层)一、基本概念和术语1 .色谱图和峰值参数咩咩咩222222咩咩咩咩咩653基线-流动相洗净，取得柱和流动相平衡后，用检测器检测出一定时间的流出曲线。 通常必须与时间轴平行。噪声(noise)基线信号的变动。 通常，电源接触不良、瞬时过载、检测器不稳定、流动相中含有气泡或柱被污染。漂移(drift )基线随时间逐渐变化。 主要是由于电压

7、、温度、流动、产水量等操作条件的不稳定，导致柱内污染物和固定相不断溶出也会产生漂移。11122222222222652流出曲线上的突起部分。 正常电色谱的峰接近对称性正态分布曲线(高斯曲线)。 非对称电色谱的峰有前延峰和后尾峰两种。分别为前者是不常见。尾随因子(tailing factor，T)-T=B/A测量电色谱峰的对称性。 t也称为对称因子(symmetry factor )或非对称因子(asymmetry factor) 中国药典，且定义为0.95到1.05。 T0.95是前延峰，T1.05是尾迹峰。峰值的底- -从基线上峰值的起点到终点的距离。峰值高度(峰高，h)从峰值的峰值到峰底的

8、距离。峰宽(peak width，W)-峰两侧拐点处两条切线与基线两个升交点之间的距离。 W=4。半峰宽(峰宽为半高，Wh/2)-峰高的一半的峰宽。 W h/2=2.355。标准离差(standard deviation，)正态分布曲线x=1时(拐点)的峰值宽度的一半。 正常峰宽的拐点是峰高的0.607倍。 标准离差的大小表示流出柱过程中成分的分散程度。 小，分散程度小，极浓度高，峰形消瘦，柱效应高，相反大，峰胖，柱效应低。峰面积(peak area，A)由峰和峰底包围的面积。 A=h=2.507h=1.064Wh/2h按幻灯片最后编辑2 .定性参数(保持值)死区时间(t0)-不保持成分的保持

9、时间。 即流动相(溶剂)通过柱的时间。 反相HPLC用苯硫酸纳金属钍测定死亡时间。从死体积(V0)进样器的样品口，到检测器流动池没有被固定相占据的空间。 这包括4个部分：从样品到柱的管道体积、柱内的固定相粒子间隙(被流动相占据，Vm )、柱出口管道体积、检测器流动池体积。 其中只有Vm参与了电色谱的平衡过程，其他三个粉只有峰值的扩大作用。 为了防止峰值扩大，这三个部分的体积应该尽可能地缩小。 V0=Ft0(F为流速)保持时间(retention time，tr ) :从采样开始到柱后某个成分的浓度极大值出现的时间。保持体积(retention volume，vr ) :从样品开始，柱后面的成分

10、显示浓度极大值时流出的溶剂的体积。 也称为溶出体积。 VR=F*tR调整预约时间(adjusted retention time，tr) -减去死亡时间的预约时间。 也称为“保留时间”(reductionretentiontime )。 如果实验条件(温度，固定相等)恒定，tr(或tr )可以稳定使用，因为tr只取决于组分的性质。 tr=tr-t 0调整预约电位器(adjusted retention volume，VR) -从预约电位器减去死体积。 VR=VR-V0或VR=f * tr3 .柱效应参数理论塔板数(theoretical plate number，n )用于定量地表示列的分离效

11、率(简称为列效果)。n取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速、测定柱效应的物质的性质。 如果峰值形状对称且符合正态概率分布，则n近似表示如下n=(tr /)2=1.6 (tr )2/w=5. 54 (tr/w1/2) 2w :峰宽:曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。当n为常数时，w与tR成比例地变化。 在一片多成分色谱图中，如果各成分的含量相当，则后溶出的峰比前峰逐渐变宽，峰的高度逐渐变低。用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算方便常用。 半峰宽度容易正确测量，特别是有尾迹的高峰。n与柱子的成长成正比，柱子越长，n越大。 用n表示柱的效果

12、时，标明柱的长度，不标明时表示柱的长度为1米时的理论塔板数。 (一般的HPLC柱的n为1000以上。 (请参见。)若利用调整保留时间(tr)计算理论塔板数，则所得值被称为有效理论塔板数(n有效或neff )=1.6 (tr/w ) 2理论架子高度(theortical plate height，h )每单位柱长的方差。 H=。 在实际应用中，多以柱长l和理论塔板数计算： H=L/N4 .相平衡参数(distribution coefficient，K)-在一定温度下化合物在两相间达到分配平衡时，固定相与流动相的浓度之比。 k=xs/XMcs溶质在固定相中的浓度cm溶剂在流动相中的浓度分配系数与

13、成分、流动相和固定相的热力学性质有关，与温度、压力有关。 在不同的电色谱分离反应历程中，k有吸附色谱法吸附系数、离子交换色谱选择系数(或交换系数)、凝胶色谱分析法渗透参数的概念。 然而，一般可以用分配系数来表示。条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度低(Cs、Cm小)时，k依赖于成分的性质，与浓度无关。 这在理想状态下的电色谱条件中，在这种条件中获得的电色谱的峰值通常是正常峰值，其中k随着浓度的增加而减少，此时电色谱的峰值可随着作为拖尾峰值的溶质浓度的增加而k也变大，其中电色谱的峰值是前延迟峰值。 因此，以尽可能少的样品量，降低列内的成分浓度，将k设为一定，才能得到正常的峰。在相同

14、的色谱分析法条件下，样品中的k值大的成分滞留在固定相中的时间长，然后流出柱的k值小的成分的滞留时间短，柱先流出。 混合物中各成分的分配系数越大越容易分离，因此混合物中各成分的分配系数不同是电色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，k主要受流动相性质的影响。 实践中主要通过调整流动相的组成配比和PH值，获得了成分间分配系数的差异和适当的保留时间，达到了分离的目的。容量因子(capacity factor，K)-化合物在两相间达到平衡时的固定相和流动相的量之比。 k=(tr-t0)/t0=tr/t0(或溶质在固定相的量/溶质在流动相的量)。 因此，电容因子也被称为质量分配系数。k=cs/cm=

15、kVM/vsk=(tr-t0)/t0=k * vs/vmvs :柱中固定相的体积； Vm :柱中流动相的体积。 以下在分配系数、容量因数和保持时间之间有k=K=、tR=kt0的关系。 上式说明了电容因子的物理意义：一个成分在固定相中停留的时间(tr)是不保持成分的时间(t0 )的数倍。 k=0时，化合物全部存在于流动相中，不保持在固定相中，tr=0； k越大，固定表示该成分的容量越大，出柱越慢，保持时间越长。电容因子和分配系数的不同，k与体积Vs、Vm无关，依赖于成分、流动相、固定相的性质和温度这一点k除了与性质和温度有关之外，也与Vs、Vm有关。 电容因子比分配系数应用得更广泛，因为tr、t

16、0比Vs、Vm更容易测量。选择系数(selectivity factor，)-相邻两个组的分配系数或容量因数之比。 =(设为k2k1)。 由于k=tr/t 0，=k2/k1，所以也被称为相对保留时间(美国药典 )。为了分离两种成分，需要1。 与固定相和流动相中化合物的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充状况无关。 本质上，的大小表示两组之间平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用的差异。5 .分离参数分离度(resolution，R)-邻接的2个峰值的保持时间之差与平均峰值宽度之比。 也称为分辨率，表示相邻两个峰的分离程度。 R=(tR2-tR1)/(W1 W2)/2，在W1=W2的情况

17、下，R=。 R=1时，称为4分离，两峰基本分离，曝光地面锋面积为95.4%，内测峰化学基约重叠2%。 在R=1.5的情况下，被称为6分离，并且曝光地面锋面积为99.7%。 R1.5称为完全分离。 中国药典规定r大于1.5。基本分离方程式分离度与3个电色谱基本参数有以下关系r=1/4(-1) n0.5 k/(1k) 其中，n称为柱效应项，为柱选择项，k为柱电容项。 柱效应项与电色谱过程的动力学特性有关，后两项与电色谱过程的热力学因素有关。从基本的分离方法可以看出，提高分离度有增加架子的数量这三种方法。 方法之一是增加柱子的长度，这将延长保持时间，增加柱子的压力。 更好的方法是降低架子的高度，提高柱子的效果。 增加选择性。 在=1时，R=0，不管列的效果如何高，分量都不能分离。 一般来说，a .通过改变流动相的组成和PH可以改变选择性b .改变柱温c .改变固定相。 改变容量因子。 这常常是提高分离度最容易的方法，可以通过调节流动相的组成来实现。 当k2变为0时，r也变为0，k2变大，r也变大。 但是，k2不能太大。 如果不这样做，不仅分离时间变长，而且峰失真变宽，影响分离度和检测灵敏度。 一般k2为110的范围，优选为25，细