上课1.2基因工程的基本操作程序

1、基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序,（1）目的基因的获取 （2） （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定,基因表达载体的构建,一、目的基因的获取,1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 2、获取方法： （1）从基因文库中获取目的基因； （2）利用PCR技术扩增目的基因； （3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成,（一）从基因文库中获取目的基因,1.什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文

2、库与cDNA文库的比较,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区

3、,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,补：真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因

4、结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,基因表达的计算,在真核生物中，对应的是 的碱基数,631,氨基酸数,碱基数,？,补充资料,基因中外显子,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,基因组文库,直接分离基因,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,cDNA文库,基因组文库与部分基因文库的关系,基因组文库和部分基因文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,思考： 如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA；

5、 基因翻译产物蛋白质等特性。,注意：,基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。,（二）利用PCR技术扩增目的基因, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。,前提条件：_； 原料：_、_ 、 _、 _。,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,DNA引物,热稳定DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,模板DNA,过程：,变性、复性、延伸三步曲,变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA 复性：冷却至5560

6、部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,思考？,1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次， 理论上至少需要几个引物？,2（2n-1）(n为循环次数),（24-1）2=30,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PC

7、R体系基本组成成分,一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补,PCR总结：,PCR的基本反应步骤,变性 90-95C,延伸 70-75C,退火 55-60C,PCR总结：,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序

8、列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,（三）化学方法人工合成目的基因,人工合成,(基因比较小),DNA合成仪,用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 用_切断目 的基因，使其产生_ _。,将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA连接酶,1.过程:,二、构建表达载体, 核心,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个

9、切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同种,过程:,2.基因表达载体的目的 （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够表达和发挥作用。,思考1：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？,不可以。,科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子

10、(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,思考2：构建目的基因表达载体，需要哪些控制元件？作用是什么？,3.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,编码区,启动子,启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？,（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达； （2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。,思考2：终

11、止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。,思考3：标记基因有什么作用？,是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,（一）转化：,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,（二

12、）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,归纳：导入受体细胞的方法。,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法,（1）农杆菌转化法,特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,转化过程:,Ti质粒 目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,利用压缩气体产生的动力，将表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。

13、,（2）基因枪法,适用于单子叶植物,（3）花粉通道法,在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于被子植物,2.将目的基因导入动物细胞,（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,（2）操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受

14、态细胞吸收DNA,3.将目的基因导入微生物细胞,思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？,用Ca2处理，增加细菌细胞壁的通透性,受精卵 体细胞,受精卵,细胞/个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注 射技术,用Ca2+处理成感受态细胞,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）A.将毒素蛋白注射到受精卵中B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中,BC,四、目的基因的检测与鉴定,检测: 是否插入目的

15、基因 是否转录 是否翻译 鉴定: 分子水平鉴定 个体生物学水平鉴定,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因, 首先取出转基因生物的基因组DNA；,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:, 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；, 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。,（一）检测,基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核苷酸序列。 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,DNA分子杂交示意图,DNA,附着在膜上,硝酸纤维素膜,加探针,报告基因（含荧光素分子

16、）,变性,DNA分子杂交 （如检测SARS病毒等）,a,b,c,d,（二）鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法:,抗原-抗体杂交,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。,提示： DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交； 抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交

17、,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？,没有抗虫基因 的棉植株,有抗虫基因的棉植株,棉铃虫,虫没有死,虫被杀死,没有表达,目的基因表达,目的基因的表达和检测,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物） 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译,

18、为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞

19、器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,寻根问底：,根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； 要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激

20、活农杆菌的诱导的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,检测是否插