HPLC分析方法的建立与开发课件

1、分析方法的确立、电色谱分离度和分离性能、HPLC分离的反应历程、电色谱知情人员感兴趣的基本问题- -电色谱峰间的分离度：tRA、mAU、time、tRB、 R=分离度tRA=成分a保持时间tRB=成分b的保持时间w=峰值的基线宽度w1/2=峰值宽度分离度值、等梯度溶出的基本分离度式、影响分离度的因素、电容因子对分离度的影响、电容因子-影响流动相组成的影响、选择性、选择性的参数， 有机成分含量低固定相有机成分含量高的固定相、柱温度对分离度的影响、柱效果、计算柱效果、典型的流速值、柱内径mm(5um粒度)、mL/min， 柱外体积的影响，Time，min .2.1 x 150 mm F=0.2 m

2、L/min .所需分离度与柱长一致，峰对称性，提高分离度，分离度与k，n的关系，液质联用流动相与固定相，流动相，GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它具有载流子作用1、理想溶剂需要以下特性：1)化学稳定性好，与固定相不相容，2 )必须适应检测器使用UV检测器时，溶剂的截止波长使用小于测定波长的折光率检测器，溶剂的折光率与测定对象物的折光率有很大不同；3 )对测定对象物具有一定的极性和选择在基线变得不稳定或产生噪声的同时，使用可以增加截止波长的有毒溶剂5 )适当的黏性系数过高，柱压过低(例如戊烷、醚等)，容易产生气泡2，溶剂的极性溶剂的强弱3、流动相的选择4、梯度洗脱的特点：缩短总的电色谱周期

3、、提高分离性能、改善峰形、减少拖尾、增加灵敏度、引起基线漂移的固定相、化学键固定相方法：通过化学反应将有机分子结合到载体表面形成柱填充(约3/4以上分离问题采用化学键固定相进行)特点：稳定、流失小，适合梯度簇射分离反应历程：兼具吸附和分配两种分离模式。 化学键的表面覆盖度决定了哪些反应历程发挥主要作用。 对于大多数结合相，以分配机制为主。 载体主要为硅凝胶(表面有烷氧基硅化学基)，粒度分布窄的多种粒度机械强度好，稳定有效的填充床的长期高压操作下不变形的反压低，柱的寿命比其他材料制成的柱高的柱效应在小分子、大分子的分析和高pH值下分解(pH8 ) 硅酯类化合物化(Si-O-R )结合固定相(2)

4、硅氮型(=Si-N=)共价键固定相(3)硅烷基化(Si-O-Si-R )结合固定相是需要注意的问题利用由硅结合相的稳定性结合色谱分析法分离的再现性结合色谱分析法分离的选择性结合相柱的再生， 化学键合色谱分析法，正相色谱分析法和反相色谱，反相色谱的定义：在非极性固定相中，以极性大的液体为流动相进行物质分离分析的方法。 即，反相色谱中结合固定相的极性必须小于流动相的极性的正相色谱分析法的定义：在极性的固定相中，将极性小的液体作为流动相进行物质分离分析的方法。 即，正相色谱分析法中结合固定相的极性采用流动相的极性、正相色谱分析法和反相色谱、正相色谱分析法和反相色谱的不同：正相结合色谱分析法、固定相：

5、以正相色谱分析法进行极性结合的固定相，为全多孔质(或壳) 对微粒硅凝胶载体进行酸活性化处理制成表面含有大量硅羟基化学基的载体后，与含有氨基化学基、腈化学基、醚化学基的硅烷化试剂反应，生成表面具有氨基化学基、腈化学基、醚基的极性固定相。 流动相：在非极性或极性小的溶剂(烃类等)中加入适当的极性溶剂(三氯甲烷、醇、乙腈等)，分离极性化合物。此时，成分的分配比k的值随着其极性的增加而增大，但随着流动相的极性的增加而降低。 主要用于分离同分异构体、极性不同的化合物，特别适合分离不同种类的化合物。 反相结合色谱分析法法采用非极性结合固定相，对全多孔(或壳)微粒硅凝胶载体进行酸活化处理后，与含有烷基链或苯

6、基化学基的硅烷化试剂反应，生成表面具有烷基化学基(或苯基化学基)的非极性固定相例如C18、C8，流动相：流动相极性强如果在稠环芳烃等低极性化合物的分离中使用一定比例的含有甲醇或乙腈的水溶液，在极性化合物的分离中使用水和无机盐的缓冲液，则可以分离容易解离的样品例如有机酸、有机盐化学基、酚类等， 具有可以得到没有拖尾的电色谱的峰值的优点，硅凝胶-烷基结合相中的烷基链长对反相电色谱的分离的影响、分析方法的确立、分析时应该理解的状况，可以有木有得到各种各样的信息，给同行制作这样的样品， 或者类似于样本的分析方法可以有木有，例如CA、AA、AOAC、EPA-设备制造商的文献可以知道自各儿的样本对柱的一盏

7、茶了解分离反应历程，自各儿正在开发方法，分析时应理解的情况(续1 )，灵敏度要求有多高样品内容复杂吗？分析的成分有多少？对分析的精度、精度等有多少要求？ 因为是日常的检查，所以要求方便使用的方法吗？ 分离(调制)时要知道，要分离(调制)的样品量是多少？要分离的成分在样品中的含量高吗？ 还是微量的，需要保持生物活性？ 分离产物对纯度的要求有多高？ 纯度和活性的鉴定是如何完成的？ 可以用于分离的化合物的参数是什么？ 分子量不同/MW 2000凝胶渗透/凝胶过滤络离子化分子离子对/络离子交换极性不同的吸附/反相电色谱同系物/苯系物的反相中性、酸和碱的混合物的反相生物分子亲和/HIC/凝胶过滤/反相立

8、体异构体吸附手性化合物手性色谱、结构数据、数据收集， 一般的具体程序首先用短的竖塔以较高的流速尽可能使用高纯度的标准品，首先用高强度的洗脱剂调节k值调节保持值有选择地调节竖塔的长度改变竖塔的效果和分离速度。 请注意，文献中的流动相是否损伤了柱需要调整流动相注意柱的规格，以使电色谱的布兰德不同：内径、柱长需要调整流速、采样量注意梯度条件，以了解系统的迟滞现象体积(梯度)，电色谱的方法转换是、 如果没有接近文献和要求的柱转换采样量转换流速，改变常规采样分离的系统方法，综合指导原则选择性就能明显改善的条件，将影响方法普遍性，减少实际问题所需的实验次数， 尽可能利用计算机仿真选择适用于各种通常的试料的

9、实验，用相同的方法确立未知试料(络离子或中性)的HPLC分析方法是以简单的实验(改变柱、改变pH、使用复杂的混合溶剂等是比较困难的条件)为开始的反相HPLC分离的总体方案设计，1， 为了确定样品是通常的还是特殊的，无机络离子映射体的生物分子合成的高分子碳水化合物同分异构体、2、选择分离条件，进行初次分离的移动相选择反相色谱常用的水/乙腈pH的思维方法，在选择低pH时变为柱硅羟基质子化， 可以缩小其电色谱活性低pH和常见的酸盐化学基官能化学基的pKa值的差，成分应避免该条件下的tR受pH变化的影响而在初期使用三氨基乙烷和络离子对试剂等添加剂，准备标准样品设置柱清洗柱， 选择以平衡检测器对分析结果进行采样的分阶段方法的开发步骤，以强洗脱剂开始等