流式细胞仪分析技术.ppt

1、20世纪70年代开发的流式细胞仪(FCM)，是快速测量、分类和收集细胞物理或化学性质(例如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)的先进技术。概述、流动单元调查(FCM)利用荧光显微镜技术利用计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多种先进技术的发展，将荧光显微镜的刺激光改为激光，提供更好的单色和激发效率，从而大大提高检测灵敏度，将固定标本台变成流动的单细胞悬浮液，用计算机处理数据时进行检测，流式细胞术(FCM)在细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学、林爽检验学等基础研究和林爽实践的各个方面具有快速、灵活、大量、敏感和定量的特性，在各个领域发挥着重

2、要作用。第一部分流式细胞术分析和分类原理第二部分数据显示和分析第三部分流式细胞术免疫分析的技术要求第四部分流式细胞术是将流体喷射技术、激光技术、空气技术、射线光谱和电子计算机技术与微荧光光度计紧密结合在一起的非常先进的检测仪器。第一部分流式细胞术的分析及分类原理，高精度和测量资料准确可靠。分析单个细胞和组细胞，以/秒为单位测量5000个细胞，保持最高99%以上的纯度。由于该仪器具有多参数、准确性、快速性和分类纯度等特性，因此广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、病理学和林爽医学领域。流式细胞术经常检测的细胞特性、用荧光色素染色的细胞或包裹在鞘溶液中的其他生物粒子、通过50100米喷嘴高速喷出的

3、聚焦光，通过各种感光元件对这些细胞或粒子发射的散射光和荧光进行计算机分析和处理，可以获得各种信息参数。一、工作原理、结构图、基本过程、(1)流动系统(2)光学系统(3)数据处理系统、1。流式细胞仪的基本结构：由样品和鞘溶液组成的被测试细胞的单细胞悬浮荧光染料标记的单电阻染色干净气体压力样品管到流动室的样品流鞘形成：正常检测辅助样品流的基质液体。主要作用是包裹样本流的周围，使样本流中的细胞位于喷嘴中心，从而接近孔壁，堵住喷射孔。(1)流式系统、流式系统图、FCM的流式系统(形成单个单元流的方法)、采样管、鞘管、激光光：空冷氩离子激光分色反射镜：反射长/短波长、短/长波长光束(3)细胞在液体柱上与

4、激光束相交时，向周围360立体角方向散射的光信号，其强弱与细胞的大小、形状、细胞内粒子折射等有关，主要分为前散射光和侧散射光。 第二，散射光测量，第二，前散射光(forward scatter，FS):激光束照射细胞时，光以相对轴的小角度(0.510)正向散射的信号用于检测细胞等粒子的表面特性，信号强弱与细胞体积大小成正比。，前光散射图，侧光散射(side scatter，SS):激光束照射细胞时光以90度散射的信号，用于检测细胞的内部结构特性。侧散射光图、测量的FS和SS信号可以通过计算机处理，得到只能将未染色的活细胞分析或分类为散射光信号的FS-SS图。这是血细胞分类的基本原理，但不能分析

5、表面分子。淋巴细胞、单核、中性粒细胞、光散射测量的最有效用途：特定子集在异种群体中确认，荧光信号在被检查细胞中显示的特定荧光染料激发后发生，释放的荧光波长与这里的光波不同。每种荧光染料可以产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性过滤器，将不同波长的散射光和荧光信号分离，然后发送到徐璐其他光电管道。通过选择不同的单个电阻和染料，可以在一个细胞内同时测定多种不同的特征。线性放大器和对数放大器，3，荧光测量，荧光染料的特性，这里的波长发射波长，荧光校正，通过流式细胞仪的细胞分类主要是在需要进一步培养和研究哪些特性的细胞时完成的。四、细胞分类原理、压电郑秀晶、机械振动生成、充电、充电、(a)分类基

6、本原理、(a)分类速度：单位时间内分类的细胞数。与悬浮液中的细胞含量成正比。分类纯度：除以所有收获的细胞的比例，选择的目的细胞。排序收获量：设置实际收获的分离细胞和通过测量点的分离细胞的比例。纯度成反比。分类产量：您可以在细胞悬浮组中确认目标细胞的总量，然后获得分类后目标细胞的实际产量。与分类速度成反比。(b)分类的技术要求，参数：FS、SS、FL数据表示方法(单参数直方图、双参数分布、二维轮廓、假三维轮廓、三参数分布)语句分析技术设置，数据的第二部分显示和分析，FS 单参数直方图2参数直方图3360点图2维轮廓3参数直方图多参数分析、直接分析矩形图、门分析3360REGION和GATE设置、

7、2、数据显示方法、一维参数(散射光或荧光)和粒子数(计数)，由相同散射或荧光强度的粒子组成，(a)单参数直方图、单参数直方图、双参数直方图：纵轴和横轴分别表示被测量细胞的两个测量参数，可以根据这两个参数确定细胞在图表中的表示位置。双参数信号通常使用对数信号，最常用的点是点密度图。其中，每个点代表一个细胞，点图表示使用粒子密度反映相同散射或荧光强度的粒子数。(b) 2参数直方图，1 .双参数直方图，双参数直方图，2 .二维轮廓图由相似地图的等高线组成，其本质也是双参数直方图。在轮廓图中，每个连续曲线都有相同的细胞相对或绝对代数，即“轮廓”。曲线的水平越高(越是内线)，代表的细胞就越多。等高线越密

8、，细胞数量的变化率就越高。二维轮廓，3 .假三维轮廓，(3)三参数直方图，多参数分析：细胞显示多色荧光，被激发后，结果荧光信号和散射光信号可以根据需要结合分析。(4)在流式细胞仪的多参数分析、闸门设置：所选参数之一的直方图中，根据该图的单元分布选择要分析的特定单元组，并要求该样本的所有其他参数组合的直方图仅反映该细胞的分布。根据门的形状，它将再次分为线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字形门。第三，门分析技术，a淋巴细胞b单核细胞c中性粒细胞，a，b，c均为弗里门，线性门，region设置3360古濑车站阈值(Region，R)和门(gate，G)，D1 CD4/cd3-D2 CD

9、4/cd3 D3 CD4-/cd3-D4 CD4-/cd3(十字分析中G=D1 D2 D3 D4)。样品制备标记染色液相芯片技术质量控制，第三部分流式细胞术免疫分析技术要求，外部外周血淋巴细胞样品制备分离单个核细胞培养细胞的样品制备蛋白酶消化系统博客，附着细胞剥离洗涤尼龙网络过滤，第一，免疫检测样品制备， 新鲜物理组织单细胞悬浮液的制备机械酶处理化学试剂处理表面活性剂处理单细胞悬浮保存低温(一年)乙醇或甲醇保存(二周)甲醛或聚甲醛保存(二月)，应用条件：将高杨紫产率和消光系数为488nm的激发光波长的强吸收发射光波长和激发光波长之间的大波长差异与标记单抗结合，不影响抗体特异性第二，常用荧光染料

10、和标记染色、激光、细胞悬浮、异硫氰酸盐氟化、状态红、能量转移复合染料、藻胆蛋白、(a)几种常用荧光染料，几种常用荧光染料用化学法将徐璐不同激发波长的两种染料结合起来，合成488nm，能量转移复合染料，488纳米，575纳米，670纳米红色荧光，花色素5，藻红蛋白，能量转移复合染料机制，荧光染料和细胞成分的四种结合结构亲和嵌入结合孔刘结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记法直接标记33366 无需显示多个抗体组合标记，(2)使用免疫荧光标记的免疫乳胶粒子的应用-液体芯片技术可以将小乳胶微球分别染色为数百种不同的荧光颜色，将徐璐不同检测对象的乳胶微球混合后，添加测试对象样本，在悬浮液中特定地结合粒

11、子，在激光照射后，对不同测量对象产生不同的颜色，进行定量分析。 检测速度很快，又被称为“液体芯片”。第三，免疫乳胶粒子技术的应用，小乳胶微球数百种不同的荧光颜色染色(固相芯片在芯片的坐标位置使用探针对基因进行特定编码；液相芯片用颜色编码，通过检测徐璐其他发光素分子，定量分析FCM中的可溶性物质，以适当的准备方式处理红细胞物理组织标本的机械法温度2537，pH7.07.2，4，流式细胞免疫学技术的质量控制，(a)用单细胞悬浮液制造的质量控制，温度pH染料浓度固定剂，(b)流动细胞免疫学技术的质量控制光电倍增管(PMT)校准：可确保检测样本时仪器处于最佳灵敏度操作状态。绝对系数校正：可确保计数精度

12、。Flow-check，Flow-set，Flow-count，(3)设备运行质量控制，相同标准：免疫荧光中的语音对照组，同源未标记单电阻作为对照，选择电压，以确保特异性。全面质量管理：与试验对象标本一起进行标记和测试，结果达到目标值，表明这次实验结果是可靠的。(4)免疫检查的质量控制，流式细胞术目前广泛应用于免疫学基础研究和逐步林爽应用的各个方面，流式细胞术将细胞表面的抗原成分进行标记分析，区分各种细胞的特性，为细胞免疫研究增加了有效的手段和帮助。第4部分流式细胞术在免疫检测中的应用；T淋巴细胞及其子集分析Th(CD3 CD4 CD8-T)；CD3 CD4-CD8 T(TC)B淋巴细胞及其亚

13、群分析B1(CD19 CD5 ):产生IgM型自身抗体，参与免疫调节，与自身免疫疾病相关的B2(CD19 CD5-):受外抗原刺激，进行高亲和力特异性抗体NK细胞分析NK(CD19 CD5-): 淋巴瘤和白血病的多色免疫表型，用于化疗选择、预后判断和小残留病变的检测等CD4 Th细胞，CD4 /CD8比例MDR()表示对化疗药物的耐药性。 4、肿瘤耐药基因分析、5、艾滋病检查中，HLA-B27在强直性脊柱炎(AIDS)患者中占58%，自身免疫疾病相关HLA抗原分析、FCM是一个强大的技术平台，在移植免疫分析中也得到越来越广泛的应用。目前，FCM在移植免疫中的应用主要包括流式细胞术(flow c

14、ytometry cross-matching，fcxm)和群体反应性抗体(Panel reactive antibody，PRA)检查。7，移植免疫应用程序，小结，流式细胞术(FCM)，在不破坏细胞及细胞器或粒子的结构和功能的情况下，在分子水平获得多种信号，定量分析或纯化单个细胞。在FCM分析中，正向散射光反映粒子的大小。侧向散射光反映了粒子内部结构的复杂性和表面的平滑度。荧光反映了粒子感染荧光部的程度，根据显示的抗原分子反映了不同抗原分子的表达。同型从免疫荧光标记到语音对照，使荧光标记单克隆抗剂的信号保持其特异性。对每个工作链路和设备性能的严格质量管理和标准化工作是FCM分析中确保每个测试

15、数据和指标可靠性的关键。以北京保税生生命技术有限公司生产的Annexin-v-FITC细胞凋亡检测套件为例，介绍annexin-v-fittc和PI双标记流式细胞检测方法。第5部分，应用实例，annexin V(Annexin-V)分子量为35-36KD的Ca2依赖性磷脂结合蛋白在细胞凋亡过程中可与膜外翻的磷脂酰丝氨酸(PS)进行修饰性特异性结合碘普罗迪丁(propidium iodide，PI)将Annexin-V与PI相匹配，就可以区分细胞凋亡的早期细胞和晚期细胞、死亡细胞。用标记为lucifer FITC的Annexin-V作为荧光探针检测细胞凋亡的发生。I，概述，(1)Annexin-v-FITC apoptosis检测套件：Annexin V-FITC(20g/ml)，缓冲组合，碘化配置文件(50g)(2)流式细胞术，2，消耗品，(1)将被测定细胞的密度调整为51051106 /ml。(2) 1ml细胞，1000rpm 4离心10分钟，上等液报废。(3)加入1毫升冷PBS，轻轻摇动，使细胞成为悬浮液。(4)1000rpm 4离心10分钟，放弃上等额。重复步骤(5)(3)(4)两次。(6)对于附着细胞