专题课题多聚酶链式反应扩增DNA片段PPT课件

1、情境导引 PCR诊断技术又叫多聚酶,链式反应技术，它采用分子技术,模拟核酸在体内的复制，从而判,定疾病病原体的种类，所以从本,质上来说，这是一种分子诊断方法。,核心要点突破,知能过关演练,课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段,基础自主梳理,基础自主梳理,一、PCR扩增的原理及条件 1概念：PCR即_，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。 2原理 (1)DNA的热变性：在80100 的温度范围内，DNA_结构解体，双链分开，这个过程称为_。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。,多聚酶链式反应,DNA,双螺旋,变性

2、,(2)子链的合成：需要_；合成方向总是从子链的5端向3端延伸。 3条件 (1)_模板。 (2)分别与模板DNA两条链相结合的两种引物。 (3)A、T、G、C四种_。 (4)耐热的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶。 (5)需要稳定的_和能严格控制_的温控设备.,引物,DNA,脱氧核苷酸,pH,温度,思考感悟 1什么是引物？若要克隆DNA，应加入几种特定的引物？ 【提示】所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。DNA是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加

3、入两种引物。,二、PCR反应过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为_、复性和延伸三步。 1变性：当温度上升到_以上时，双链DNA解聚为单链。 2复性：温度下降到_左右，两种引物通过_与两条单链DNA结合。 3延伸：温度上升到_左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在_的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。,变性,90 ,50 ,碱基互补配对,72 ,DNA聚合酶,思考感悟 2PCR循环过程中，变性温度设置95 ，时间设置30 s的原因是什么？ 【提示】变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增。变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。,三、实验

4、操作 1实验用具 (1)PCR仪：该仪器能自动调控_，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个_代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。 (2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行离心的场所。 (3)微量移液器：用于吸取转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更换。,温度,恒温水浴锅,2操作步骤 准备_混合_反应。 四、操作提示 1为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行_。 2所用的_和酶应分装成小份，并在20 储存。 五、DNA含量的测定 1原理：利用DNA在260 nm的紫外线波段的_曲线来测定相应含

5、量。 2计算公式：DNA含量(g)50(260 nm的读数)_。,移液,离心,高压灭菌,缓冲液,吸收,稀释倍数,核心要点突破,1PCR扩增方向：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(OH)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。,2PCR原理DNA的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。,3生物体内DNA复制与PCR反应的区别,(2011年聊城高二检测)下列关于DNA复制和PCR的描述中，正确的是() ADNA聚

6、合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链 BDNA复制不需要引物 C引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合 DPCR扩增的对象是氨基酸序列 【尝试解答】_C_,【解析】由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链，故DNA复制需要引物，而且它与DNA母链通过碱基互补配对结合。PCR扩增的对象是DNA，而不是氨基酸。 【探规寻律】(1)引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。包括引物和引物两种。用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸。 (2)细胞内DNA复制与PCR技术的原理和过程容易发生混淆，特别应注意区分PCR反应需要可变的温度，

7、而体内DNA复制需要稳定的温度。,跟踪训练(2011年海淀区高二检测)关于DNA片段PCR扩增实验的描述中不正确的是() A加入的Taq DNA聚合酶耐高温 B不同大小DNA在电场中迁移速率不同 C此过程需要DNA连接酶 D扩增区域由两种引物来决定,解析：选C。PCR扩增实验是在较高温度下进行的，故需要耐高温的Taq DNA聚合酶，但不需要DNA连接酶，A项正确，C项错误。因为不同大小的DNA带有不同数量的电荷，所以在电场中迁移速率不同，B项正确。PCR扩增需要两种引物，分别与DNA的两条模板链互补，则D项正确。,1反应体系的配方,2.实验用具 (1)PCR仪：PCR自动化程度较高，参照下表设

8、计程序即可。,若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替，三个恒温水浴锅的温度分别为94 、55 和72 ，然后按照上表要求，在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。 (2)微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为0.5 mL。 (3)微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。,3实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照配方在微量试管中依次加入各组分 盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 将微量离心管放在离心机上，离心约10 min 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序,(2011年长春高二检测)多聚酶链式反应

9、(PCR技术)是在实验室中以少量样品DNA制备大量DNA的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸等。反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，故DNA数以指数方式扩增，其简要过程如图所示。,(1)某个DNA样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基AGTC1234，则经过PCR仪五次循环后，将产生_个DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是_个。 (2)分别以不同生物的DNA样品为模板合成的各个新DNA之间存在差异，这些差异是 _。,(3)由于DNA分子上的“遗传因子”基本都是符合孟德尔的遗传规律的，因此人类可以利用PCR技

10、术合成的DNA进行亲子鉴定，其原理是：首先获取被测试者的DNA，并进行PCR扩增，取其中一样本DNA用限制性核酸内切酶切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA小片段分离，再使用特别的“探针”去寻找基因。相同的基因会凝聚在一起，然后利用特别的染料在X光下，便会显示由DNA探针凝聚于一起的黑色条码。每个人的条码一半与其母亲的条码吻合，另一半与其父亲的条码吻合。,限制性核酸内切酶能将DNA样品切成特定的小片段，这主要体现了酶的_。 A专一性B高效性 C多样性 D作用条件温和 2002年6月，我国第一张18位点的“基因身份证明”在湖北武汉诞生。人的“基因身份证明”是否终身有效？_，理由是_ _。

11、,(4)请指出PCR技术与转录过程的三个不同之处： _； _； _。,【尝试解答】(1)326200 (2)碱基(脱氧核苷酸)的数目、比例和排列顺序不同 (3)A 是因为同一个体的不同生长发育阶段和不同组织的DNA是相同的，所以它有高度的个体特异性和稳定性 (4)PCR技术以DNA的两条单链为模板合成子代DNA，转录以DNA的一条单链为模板合成RNA PCR技术的原料为脱氧核苷酸，转录的原料是核糖核苷酸 二者反应时的催化酶不同(或其他合理答案),【解析】本题考查了PCR技术的应用及相关计算与识图能力。(1)该DNA样品复制5次，产生DNA分子数为2532个，DNA样品中TA200个，则样品复制5次，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少为200(251)6200个。(2)不同生物的DNA样品中，脱氧核苷酸(碱基)数目、比例和排列顺序不同,故各个新DNA之间也存在差异。(3)限制性核酸内切酶能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定部位进行切割，这就说明酶具有专一性；人的“基因身份证明”是根据DNA上的